Визуализация морфогенеза глаза с помощью микроскопии Lightsheet с использованием rx3: GFP Трансгенные рыбки данио

Развитие глаза позвоночных является сложным процессом, который начинается ближе к концу гаструляции эмбриона и требует точной координации миграции клеток, пролиферации и дифференцировки. Покадровое воображение дает уникальное представление о поведении клеток во время развития глаз, потому что оно позволяет нам визуализировать окулогенез in vivo. Рыбки данио являются отличной моделью для визуализации этого процесса из-за их высококонсервированного глаза позвоночных и их способности быстро и внешне развиваться, оставаясь оптически прозрачными. Покадровые исследования развития глаз рыбок данио значительно облегчаются использованием трансгенной линии рыбок данио Tg(rx3: GFP). В развивающемся переднем мозге экспрессия rx3: GFP отмечает клетки одного глазного поля, и GFP продолжает экспрессироваться, когда глазное поле уклоняется, образуя зрительный пузырь, который затем инвагинируется, образуя оптическую чашку. Таким образом, покадровая визуализация экспрессии rx3: GFP с высоким разрешением позволяет нам отслеживать примордий глаза во времени, когда он развивается в сетчатку. Световой микроскопия является идеальным методом для изображения глазного морфогенеза с течением времени из-за его способности проникать в более толстые образцы для флуоресцентной визуализации, минимизировать фотоотбеливание и фототоксичность, а также изображение на высокой скорости. Здесь предусмотрен протокол для покадровой визуализации морфогенеза глаза с использованием коммерчески доступного светового микроскопа и рабочей станции обработки изображений для анализа полученных данных. В этом протоколе подробно описываются процедуры анестезии эмбрионов, встраивание агарозы с низкой температурой плавления, суспензия в камере визуализации, настройка параметров визуализации и, наконец, анализ данных визуализации с использованием программного обеспечения для анализа изображений. Полученный набор данных может дать ценную информацию о процессе морфогенеза глаз, а также о возмущениях этого процесса в результате генетической мутации, воздействия фармакологических агентов или других экспериментальных манипуляций.