تحليل أنماط حركية السدادة أثناء وبعد تجديد الجهاز الفموي باستخدام تتبع الخلايا

Published: April 26th, 2021

DOI:

10.3791/62352

Janet Y. Sheung¹, Megan Otsuka², Gabriella Seifert³, Athena Lin⁴, Wallace F. Marshall⁴

¹W. M. Keck Science Department, Scripps, Pitzer, and Claremont McKenna of The Claremont Colleges, ²W. M. Keck Science Department, Pitzer College, ³W. M. Keck Science Department, Scripps College, ⁴Department of Biochemistry and Biophysics, School of Medicine, University of California at San Francisco

نقدم بروتوكولا لتوصيف حركية وسلوك مجموعة من مائة خلية بحجم ميكرون إلى ملليمتر باستخدام المجهر الساطع وتتبع الخلايا. يكشف هذا الفحص أن Stentor coeruleus ينتقل عبر أربع مراحل متميزة سلوكيا عند تجديد جهاز فموي مفقود.

Stentor coeruleus هو كائن حي نموذجي معروف لدراسة التجديد أحادي الخلية. كشف التحليل النسخي للخلايا الفردية عن مئات الجينات - العديد منها غير مرتبط بالجهاز الفموي (OA) - التي يتم تنظيمها بشكل تفاضلي على مراحل طوال عملية التجديد. كان من المفترض أن إعادة التنظيم المنهجي وتعبئة الموارد الخلوية نحو نمو OA جديد سيؤدي إلى تغييرات ملحوظة في الحركة والسلوك المقابلة في الوقت المناسب لمراحل التعبير الجيني التفاضلي. ومع ذلك ، فإن التعقيد المورفولوجي ل S. coeruleus استلزم تطوير فحص لالتقاط الإحصاءات والجدول الزمني. تم استخدام برنامج نصي مخصص لتتبع الخلايا في مقاطع فيديو قصيرة ، وتم تجميع الإحصاءات على عدد كبير من السكان (N ~ 100). عند فقدان OA ، يفقد S. coeruleus في البداية القدرة على الحركة الموجهة ؛ ثم بدءا من ~ 4 ساعات ، فإنه يظهر انخفاضا كبيرا في السرعة حتى ~ 8 ساعات. يوفر هذا الفحص أداة مفيدة لفحص الأنماط الظاهرية الحركية ويمكن تكييفها للتحقيق في الكائنات الحية الأخرى.

Stentor coeruleus (Stentor) هو كائن حي نموذجي معروف تم استخدامه لدراسة التجديد أحادي الخلية بسبب حجمه الكبير ، وقدرته على تحمل العديد من تقنيات الجراحة المجهرية ، وسهولة الاستزراع في بيئة مختبرية¹،²^،³. ركزت دراسات التجديد المبكر على أكبر ميزة وأكثرها تميزا من الناحية المورفولوجية في Stentor - OA - التي يتم إلقاؤها بالكامل على الصدمة الكيميائية⁴،⁵^،⁶. يبدأ استبدال OA المفقود بظهور نطاق غشائي جديد - مجموعة من الأهداب التي تتحول تدريجيا نحو الجزء الأما....

ملاحظة: تم استزراع مجموعة من حوالي مائة خلية S. coeruleus وفقا لبروتوكول JoVE⁸ المنشور سابقا.

1. إعداد العينات

قطع قطعة من ورقة فاصل السيليكون بسماكة 250 ميكرومتر (جدول المواد) أصغر قليلا في كل من الارتفاع والعرض من شريحة المجهر. باستخدام ثقب 5/16 "لكمة ، ?.......

الهدف من هذا الفحص هو تحديد التغير التدريجي لأنماط الحركة والزيادة التدريجية في سرعة الحركة من الخلايا داخل مجموعة كبيرة (N ~ 100) من Stentor المجددة. للمساعدة في تفسير النتائج ، يولد الرمز المخصص المضمن في هذا البروتوكول نوعين من المؤامرات: تراكب لجميع آثار حركة الخلية في مجموعة من بيانات ?.......

توجد حاليا العديد من خوارزميات تتبع الجسيمات والخلايا ، بعضها مجاني تماما. غالبا ما تكون التكلفة وسهولة الاستخدام مقايضات تتطلب حلا وسطا. بالإضافة إلى ذلك ، تم تصميم العديد من برامج تتبع الخلايا الحالية لتتبع حركة الزحف البطيئة لخلايا زراعة الأنسجة ، بدلا من حركة السباحة السريعة ل Stentor<.......

تم دعم هذا العمل ، جزئيا ، من قبل زمالة ويتمان للمختبر البيولوجي البحري المبكر (JYS). نحن نقدر إيفان بيرنز وميت باتيل وميلاني ميلو وسكايلار ويدمان للمساعدة في بعض التحليلات الأولية واختبار الشفرات. ونشكر مارك سلابودنيك على المناقشة والاقتراحات. تعترف WFM بالدعم المقدم من منحة المعاهد الوطنية للصحة R35 GM130327.

....

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25 mm-thick silicone sheet	Grace Bio-Labs	CWS-S-0.25
24 x 50 mm, #1.5 coverglass	Fisher Scientific	NC1034527	As noted in Discussion, smaller coverglass can be used if fewer sample wells are placed on one slide.
CCD camera			We used Nikon D750
Chlamydomonas 137c WT strain	Chlamydomonas Resource Center	CC-125
MATLAB	MATHWORKS
MATLAB Image Processing Toolbox	MATHWORKS		needed for TrackCells.m and CleanTraces.m
MATLAB Statistics and Machine Learning Toolbox	MATHWORKS		needed for TrackCells.m
Microscope with camera port			We used Zeiss AxioZoom v1.6 and Leica S9E
Pasteurized Spring Water	Carolina	132458
TAP Growth Media	ThermoFisher Scientific	A1379801	Can also be made for much cheaper following recipe from Chlamy Resource Center

Lillie, F. R. On the smallest parts of stentor capable of regeneration; a contribution on the limits of divisibility of living matter. Journal of Morphology. 12 (1), 239-249 (1896).
Morgan, T. H. Regeneration of proportionate structures in Stentor. The Biological Bulletin. 2 (6), 311-328 (1901).
Tartar, V., Kerkut, G. A. . The Biology of Stentor. , (1961).
Tartar, V. Reactions of Stentor coeruleus to certain substances added to the medium. Experimental Cell Research. 13 (2), 317-332 (1957).
Kelleher, J. K. A kinetic model for microtubule polymerization during oral regeneration in Stentor coeruleus. Biosystems. 9 (4), 269-279 (1977).
Slabodnick, M. M., et al. The kinase regulator Mob1 acts as a patterning protein for Stentor morphogenesis. PLOS Biology. 12 (5), 1001861 (2014).
Wan, K. Y., et al. Reorganization of complex ciliary flows around regenerating Stentor coeruleus. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 375 (1792), 20190167 (2020).
Lin, A., Makushok, T., Diaz, U., Marshall, W. F. Methods for the study of regeneration in Stentor. Journal of Visualized Experiments JoVE. (136), e57759 (2018).
Sood, P., McGillivary, R., Marshall, W. F. The transcriptional program of regeneration in the giant single cell, Stentor coeruleus. bioRxiv. , 240788 (2017).
Onsbring, H., Jamy, M., Ettema, T. J. G. RNA sequencing of Stentor cell fragments reveals transcriptional changes during cellular regeneration. Current Biology. 28 (8), 1281-1288 (2018).