使用细胞追踪分析口腔器械再生期间和之后的张力模式

我们提出了一种方案，用于使用明场显微镜和细胞跟踪来表征数百微米至毫米级细胞群的运动性和行为。该测定表明，在再生丢失的口腔器械时， Stentor coeruleus 通过四个行为上不同的阶段过渡。

鞘翅目 是一种著名的单细胞再生研究模式生物。单个细胞的转录组学分析揭示了数百个基因 - 许多与口腔器官（OA）无关 - 这些基因在整个再生过程中的各个阶段受到差异调节。据推测，这种系统性重组和细胞资源向新OA生长的动员将导致运动和行为的可观察到的变化，这些变化与差异基因表达的各个阶段相对应。然而， Coeruleus 的形态复杂性使得有必要开发一种测定方法来捕获统计数据和时间尺度。使用自定义脚本在短视频中跟踪细胞，并在大量群体（N ~100）上编译统计数据。在OA丧失后， 科鲁勒斯链球菌 最初失去定向运动的能力;然后从~4小时开始，它表现出速度的显着下降，直到〜8小时。该测定法为筛选运动表型提供了有用的工具，并且可以适用于其他生物体的研究。

Stentor coeruleus （Stentor）是一种众所周知的模式生物，由于其体积大，能够承受多种显微外科技术并且易于在实验室环境中培养，因此已被用于研究单细胞再生^1，2，3。早期的再生研究集中在 Stentor中最大和形态上最独特的特征 - OA - 它在化学休克^4，5，6时完全脱落。从 头 替换丢失的OA始于新膜束带的出现 - 一组纤毛，在八个形态阶段形成功能性OA之前逐渐向细胞前部移动³。无论温度如何，这些阶段都是按顺序观察到的，并为几乎所有研究提供了通用参考点⁵。

Stentor再生的机械分析需要用于测量再生时间的工具，这些工具足够坚固且简单，可以作为化学或分子筛选的一部分应用于多个样品。进行基于细胞的测定的标准方法是成像，在这种情况下，在再生过程中成像新OA的形成。然而，当再生结构包含可用作标记物的不同分子....

注意：根据先前发表的JoVE方案⁸培养了大约100个科鲁勒斯链球菌细胞。

1. 样品制备

1. 切割一块250μm厚的硅胶间隔片（材料表），其高度和宽度都比显微镜载玻片略小。使用 5/16“ 打孔机，创建圆形孔。注意在相邻的井之间留出足够的空间，以确保良好的密封性。
   注：发现相邻井之间3毫米的空间就足够了。通过练习，可以将十口孔.......

该测定的目的是量化运动模式的逐渐变化和大型（N〜100）再生Stentor群体中细胞运动速度的逐步增加。为了帮助解释结果，该协议中包含的自定义代码生成两种类型的图：一组视频数据中所有细胞运动迹线的叠加（图1C-F和图S1），以及自再生开始以来按小时划分的游泳速度图（图2C）。正常再生的Stentor

目前存在许多粒子和细胞跟踪算法，其中一些是完全免费的。成本和用户友好性通常是需要妥协的权衡。此外，许多现有的细胞跟踪程序被设计为跟踪组织培养细胞的缓慢爬行运动，而不是Stentor的快速游泳运动， Stentor在游泳时旋转并可能经历突然的方向变化。在测试了许多这些选项之后，这里介绍的协议旨在成为一站式解决方案，仅使用低成本设备和单个科学软件包（材料表

这项工作得到了海洋生物实验室惠特曼早期职业奖学金（JYS）的部分支持。我们感谢埃文·伯恩斯、米特·帕特尔、梅兰妮·梅洛和斯凯拉·威德曼帮助进行了一些初步分析和代码测试。我们感谢马克·斯拉博德尼克的讨论和建议。WFM感谢NIH拨款R35 GM130327的支持。