Analyse van motiliteitspatronen van stentor tijdens en na orale apparaatregeneratie met behulp van celtracking

We presenteren een protocol voor de karakterisering van beweeglijkheid en gedrag van een populatie van honderd micron- tot millimetergrote cellen met behulp van brightfield-microscopie en celtracking. Deze test onthult dat Stentor coeruleus door vier gedragsmatig verschillende fasen gaat bij het regenereren van een verloren oraal apparaat.

Stentor coeruleus is een bekend modelorganisme voor de studie van eencellige regeneratie. Transcriptomische analyse van individuele cellen onthulde honderden genen - veel niet geassocieerd met het orale apparaat (OA) - die differentieel gereguleerd zijn in fasen tijdens het regeneratieproces. Er werd verondersteld dat deze systemische reorganisatie en mobilisatie van cellulaire middelen naar de groei van een nieuwe artrose zal leiden tot waarneembare veranderingen in beweging en gedrag die in de tijd overeenkomen met de fasen van differentiële genexpressie. De morfologische complexiteit van S. coeruleus maakte echter de ontwikkeling van een test noodzakelijk om de statistieken en de tijdschaal vast te leggen. Een aangepast script werd gebruikt om cellen in korte video's te volgen en statistieken werden samengesteld over een grote populatie (N ~ 100). Bij verlies van de OA verliest S. coeruleus aanvankelijk het vermogen tot gerichte beweging; dan vanaf ~ 4 uur, vertoont het een aanzienlijke daling van de snelheid tot ~ 8 uur. Deze test biedt een nuttig hulpmiddel voor de screening van motiliteitsfenotypen en kan worden aangepast voor het onderzoek van andere organismen.

Stentor coeruleus (Stentor) is een bekend modelorganisme dat is gebruikt om eencellige regeneratie te bestuderen vanwege zijn grote omvang, vermogen om verschillende microchirurgische technieken te weerstaan en het gemak van kweken in een laboratoriumomgeving ^1,2,3. Vroege regeneratiestudies richtten zich op het grootste en meest morfologisch onderscheidende kenmerk in Stentor - de OA - die volledig wordt afgeworpen op chemische shock ^4,5,6. De novo

OPMERKING: Een populatie van ongeveer honderd S. coeruleuscellen werd gekweekt in overeenstemming met een eerder gepubliceerd JoVE-protocol⁸.

1. Monstervoorbereiding

1. Snijd een stuk van 250 μm dik siliconen afstandsblad (Table of Materials) iets kleiner in zowel hoogte als breedte dan een microscoopglaasje. Maak met behulp van een 5/16"-perforator cirkelvormige putten. Houd er rekening mee dat u voldoende ruimte tussen naburige putten.......

Het doel van deze test is om de geleidelijke verandering van bewegingspatronen en gefaseerde toename van bewegingssnelheid van cellen binnen een grote (N ~ 100) regenererende Stentorpopulatie te kwantificeren. Om de interpretatie van de resultaten te vergemakkelijken, genereert de aangepaste code in dit protocol twee soorten plots: een overlay van alle celbewegingssporen in een reeks videogegevens (figuur 1C-F en figuur S1) en een p.......

Er bestaan momenteel veel algoritmen voor het volgen van deeltjes en cellen, sommige volledig gratis. Kosten en gebruiksvriendelijkheid zijn vaak afwegingen die compromissen vereisen. Bovendien zijn veel van de bestaande celvolgprogramma's ontworpen om de langzame kruipbeweging van weefselkweekcellen te volgen, in plaats van de snelle zwembeweging van Stentor, die tijdens het zwemmen roteert en plotselinge richtingsveranderingen kan ondergaan. Na het testen van veel van deze opties, is het hier gepresenteerde pr.......

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door Marine Biological Laboratory Whitman Early Career Fellowship (JYS). We erkennen Evan Burns, Mit Patel, Melanie Melo en Skylar Widman voor hun hulp bij een deel van de voorlopige analyse en codetests. Wij danken Mark Slabodnick voor de discussie en suggesties. WFM erkent steun van NIH-subsidie R35 GM130327.