Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Biology
Nous présentons un protocole pour la caractérisation de la motilité et du comportement d’une population de cellules de taille cent microns à millimètres en utilisant la microscopie à fond clair et le suivi cellulaire. Ce test révèle que Stentor coeruleus passe par quatre phases comportementalement distinctes lors de la régénération d’un appareil buccal perdu.
Stentor coeruleus est un organisme modèle bien connu pour l’étude de la régénération unicellulaire. L’analyse transcriptomique de cellules individuelles a révélé des centaines de gènes – dont beaucoup ne sont pas associés à l’appareil buccal (OA) – qui sont régulés différemment par phases tout au long du processus de régénération. On a émis l’hypothèse que cette réorganisation systémique et cette mobilisation des ressources cellulaires vers la croissance d’une nouvelle arthrose entraîneront des changements observables dans le mouvement et le comportement correspondant dans le temps aux phases d’expression différentielle des gènes. Cependant, la complexité morphologique de S. coeruleus a nécessité le développement d’un test pour capturer les statistiques et l’échelle de temps. Un script personnalisé a été utilisé pour suivre les cellules dans de courtes vidéos, et des statistiques ont été compilées sur une grande population (N ~ 100). Lors de la perte de l’OA, S. coeruleus perd initialement la capacité de mouvement dirigé; puis à partir de ~4 h, il présente une baisse significative de vitesse jusqu’à ~8 h. Ce test fournit un outil utile pour le dépistage des phénotypes de motilité et peut être adapté pour l’étude d’autres organismes.
Stentor coeruleus (Stentor) est un organisme modèle bien connu qui a été utilisé pour étudier la régénération unicellulaire en raison de sa grande taille, de sa capacité à résister à plusieurs techniques microchirurgicales et de sa facilité de culture en laboratoire 1,2,3. Les premières études de régénération se sont concentrées sur la caractéristique la plus importante et la plus morphologiquement distincte de Stentor – l’ARTH – qui est complètement éliminée lors d’un choc chimique 4,5,6
NOTE: Une population d’environ cent cellules de S. coeruleus a été cultivée conformément à un protocole JoVE8 publié précédemment.
1. Préparation de l’échantillon
L’objectif de ce test est de quantifier le changement progressif des schémas de mouvement et l’augmentation progressive de la vitesse de mouvement des cellules au sein d’une grande population de stentors régénérants (N ~ 100). Pour faciliter l’interprétation des résultats, le code personnalisé inclus dans ce protocole génère deux types de tracés : une superposition de toutes les traces de mouvement des cellules dans un ensemble de données vidéo (Figure 1C-F
De nombreux algorithmes de suivi des particules et des cellules existent actuellement, certains entièrement gratuits. Le coût et la convivialité sont souvent des compromis qui nécessitent des compromis. De plus, de nombreux programmes de suivi cellulaire existants sont conçus pour suivre le mouvement lent des cellules de culture tissulaire, plutôt que le mouvement de nage rapide de Stentor, qui tourne pendant la natation et peut subir des changements soudains de direction. Après avoir testé bon nombre de.......
Ce travail a été soutenu, en partie, par le Marine Biological Laboratory Whitman Early Career Fellowship (JYS). Nous remercions Evan Burns, Mit Patel, Melanie Melo et Skylar Widman pour leur aide dans l’analyse préliminaire et les tests de code. Nous remercions Mark Slabodnick pour ses discussions et ses suggestions. WFM reconnaît le soutien de la subvention R35 GM130327 des NIH.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.25 mm-thick silicone sheet | Grace Bio-Labs | CWS-S-0.25 | |
24 x 50 mm, #1.5 coverglass | Fisher Scientific | NC1034527 | As noted in Discussion, smaller coverglass can be used if fewer sample wells are placed on one slide. |
CCD camera | We used Nikon D750 | ||
Chlamydomonas 137c WT strain | Chlamydomonas Resource Center | CC-125 | |
MATLAB | MATHWORKS | ||
MATLAB Image Processing Toolbox | MATHWORKS | needed for TrackCells.m and CleanTraces.m | |
MATLAB Statistics and Machine Learning Toolbox | MATHWORKS | needed for TrackCells.m | |
Microscope with camera port | We used Zeiss AxioZoom v1.6 and Leica S9E | ||
Pasteurized Spring Water | Carolina | 132458 | |
TAP Growth Media | ThermoFisher Scientific | A1379801 | Can also be made for much cheaper following recipe from Chlamy Resource Center |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved