सेल ट्रैकिंग का उपयोग करके मौखिक उपकरण पुनर्जनन के दौरान और बाद में स्टेंटर के गतिशीलता पैटर्न का विश्लेषण

Published: April 26th, 2021

DOI:

10.3791/62352

Janet Y. Sheung¹, Megan Otsuka², Gabriella Seifert³, Athena Lin⁴, Wallace F. Marshall⁴

¹W. M. Keck Science Department, Scripps, Pitzer, and Claremont McKenna of The Claremont Colleges, ²W. M. Keck Science Department, Pitzer College, ³W. M. Keck Science Department, Scripps College, ⁴Department of Biochemistry and Biophysics, School of Medicine, University of California at San Francisco

हम ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी और सेल ट्रैकिंग का उपयोग करके सौ माइक्रोन से मिलीमीटर आकार की कोशिकाओं की आबादी की गतिशीलता और व्यवहार के लक्षण वर्णन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इस परख से पता चलता है कि स्टेंटर कोएरुलस एक खोए हुए मौखिक तंत्र को पुनर्जीवित करते समय चार व्यवहारिक रूप से अलग-अलग चरणों के माध्यम से संक्रमण करता है।

स्टेंटर कोएरुलस एककोशिकीय उत्थान के अध्ययन के लिए एक प्रसिद्ध मॉडल जीव है। व्यक्तिगत कोशिकाओं के ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण से सैकड़ों जीनों का पता चला- कई मौखिक तंत्र (ओए) से जुड़े नहीं हैं- जो पुनर्जनन प्रक्रिया के दौरान चरणों में अलग-अलग विनियमित होते हैं। यह परिकल्पना की गई थी कि एक नए ओए के विकास की दिशा में सेलुलर संसाधनों के इस प्रणालीगत पुनर्गठन और जुटाने से अंतर जीन अभिव्यक्ति के चरणों के अनुरूप आंदोलन और व्यवहार में अवलोकन योग्य परिवर्तन होंगे। हालांकि, एस कोएरुलस की रूपात्मक जटिलता ने आंकड़ों और टाइमस्केल को पकड़ने के लिए एक परख के विकास की आवश्यकता थी। लघु वीडियो में कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए एक कस्टम स्क्रिप्ट का उपयोग किया गया था, और आंकड़े एक बड़ी आबादी (एन ~ 100) पर संकलित किए गए थे। ओए के नुकसान पर, एस कोएरुलस शुरू में निर्देशित गति की क्षमता खो देता है; फिर ~ 4 घंटे से शुरू होकर, यह ~ 8 घंटे तक गति में एक महत्वपूर्ण गिरावट प्रदर्शित करता है। यह परख गतिशीलता फेनोटाइप की स्क्रीनिंग के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान करता है और अन्य जीवों की जांच के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

स्टेंटर कोएरुलस (स्टेंटर) एक प्रसिद्ध मॉडल जीव है जिसका उपयोग अपने बड़े आकार, कई माइक्रोसर्जिकल तकनीकों का सामना करने की क्षमता और प्रयोगशाला सेटिंग ^1,2,3 में संवर्धन में आसानी के कारण एककोशिकीय उत्थान का अध्ययन करने के लिए किया गया है। प्रारंभिक उत्थान अध्ययन स्टेंटर में सबसे बड़ी और सबसे रूपात्मक रूप से विशिष्ट विशेषता पर केंद्रित है- ओए- जो पूरी तरह से रासायनिक सदमे ^4,5,6 पर बहाया जाता है। खोए हुए ओए का डे नोवो प्रतिस्थापन एक नए झिल्लीदार बैंड ....

नोट: लगभग एक सौ एस कोएरुलस कोशिकाओं की आबादी पहले प्रकाशित जोव प्रोटोकॉल⁸ के अनुसार सुसंस्कृत थे।

1. नमूना तैयारी

माइक्रोस्कोप स्लाइड की तुलना में ऊंचाई और चौड़ाई दोनों में थ?.......

इस परख का लक्ष्य आंदोलन पैटर्न के क्रमिक परिवर्तन और एक बड़े (एन ~ 100) पुनर्जन्म स्टेंटर आबादी के भीतर कोशिकाओं से आंदोलन की गति में चरणबद्ध वृद्धि की मात्रा निर्धारित करना है। परिणामों की व्याख्या म?.......

कई कण और सेल ट्रैकिंग एल्गोरिदम वर्तमान में मौजूद हैं, कुछ पूरी तरह से मुक्त हैं। लागत और उपयोगकर्ता-मित्रता अक्सर व्यापार-नापसंद होते हैं जिन्हें समझौता करने की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, कई मौ.......

इस काम को समुद्री जैविक प्रयोगशाला व्हिटमैन अर्ली कैरियर फैलोशिप (जेवाईएस) द्वारा भाग में समर्थित किया गया था। हम प्रारंभिक विश्लेषण और कोड परीक्षण में से कुछ में मदद करने के लिए इवान बर्न्स, मिट पटेल, मेलानी मेलो और स्काईलर विडमैन को स्वीकार करते हैं। हम चर्चा और सुझावों के लिए मार्क स्लैबोनिक को धन्यवाद देते हैं। डब्ल्यूएफएम एनआईएच अनुदान आर 35 जीएम 130327 से समर्थन स्वीकार करता है।

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Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25 mm-thick silicone sheet	Grace Bio-Labs	CWS-S-0.25
24 x 50 mm, #1.5 coverglass	Fisher Scientific	NC1034527	As noted in Discussion, smaller coverglass can be used if fewer sample wells are placed on one slide.
CCD camera			We used Nikon D750
Chlamydomonas 137c WT strain	Chlamydomonas Resource Center	CC-125
MATLAB	MATHWORKS
MATLAB Image Processing Toolbox	MATHWORKS		needed for TrackCells.m and CleanTraces.m
MATLAB Statistics and Machine Learning Toolbox	MATHWORKS		needed for TrackCells.m
Microscope with camera port			We used Zeiss AxioZoom v1.6 and Leica S9E
Pasteurized Spring Water	Carolina	132458
TAP Growth Media	ThermoFisher Scientific	A1379801	Can also be made for much cheaper following recipe from Chlamy Resource Center

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