Анализ паттернов подвижности стентора во время и после регенерации ротового аппарата с помощью отслеживания клеток

Представлен протокол для характеристики подвижности и поведения популяции клеток размером от ста микрон до миллиметра с использованием микроскопии яркого поля и отслеживания клеток. Этот анализ показывает, что Stentor coeruleus переходит через четыре поведенчески различные фазы при регенерации утраченного орального аппарата.

Stentor coeruleus является известным модельным организмом для изучения одноклеточной регенерации. Транскриптомный анализ отдельных клеток выявил сотни генов, многие из которых не связаны с оральным аппаратом (ОА), которые дифференциально регулируются фазами на протяжении всего процесса регенерации. Была выдвинута гипотеза, что эта системная реорганизация и мобилизация клеточных ресурсов в сторону роста новой ОА приведет к наблюдаемым изменениям в движении и поведении, соответствующим по времени фазам дифференциальной экспрессии генов. Однако морфологическая сложность S. coeruleus потребовала разработки анализа для захвата статистики и временных рамок. Пользовательский скрипт использовался для отслеживания клеток в коротких видеороликах, а статистика была собрана по большой популяции (N ~ 100). При потере ОА S. coeruleus первоначально теряет способность к направленному движению; затем, начиная с ~ 4 ч, он демонстрирует значительное падение скорости до ~ 8 ч. Этот анализ обеспечивает полезный инструмент для скрининга фенотипов подвижности и может быть адаптирован для исследования других организмов.

Stentor coeruleus (Стентор) является хорошо известным модельным организмом, который был использован для изучения одноклеточной регенерации благодаря своим большим размерам, способности выдерживать несколько микрохирургических методов и простоте культивирования в лабораторных условиях ^1,2,3. Ранние исследования регенерации были сосредоточены на самой большой и наиболее морфологически отличной особенности Стентора — ОА, которая полностью исчезает при химическом шоке ^4,5,6

ПРИМЕЧАНИЕ: Популяцию из примерно ста клеток S. coeruleus культивировали в соответствии с ранее опубликованным протоколом^{JoVE 8}.

1. Пробоподготовка

1. Вырежьте кусок силиконового распорного листа толщиной 250 мкм (Таблица материалов), немного меньший

Целью этого анализа является количественная оценка постепенного изменения моделей движения и поэтапного увеличения скорости движения из клеток в пределах большой (N ~ 100) регенерирующей популяции стентора. Чтобы облегчить интерпретацию результатов, пользовательский код, включен?.......

В настоящее время существует множество алгоритмов отслеживания частиц и клеток, некоторые из них полностью бесплатны. Стоимость и удобство для пользователя часто являются компромиссами, требующими компромисса. Кроме того, многие из существующих программ отслеживания клеток предназн.......

Эта работа была поддержана, в частности, Морской биологической лабораторией Whitman Early Career Fellowship (JYS). Мы благодарим Эвана Бернса, Мита Пателя, Мелани Мело и Скайлара Уидмана за помощь в предварительном анализе и тестировании кода. Мы благодарим Марка Слободника за обсуждение и предложения. WFM признает поддержку гранта NIH R35 GM130327.