Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Biology
Presentamos un protocolo para la caracterización de la motilidad y el comportamiento de una población de células de cien micras a milímetros utilizando microscopía de campo brillante y seguimiento celular. Este ensayo revela que Stentor coeruleus pasa por cuatro fases conductualmente distintas al regenerar un aparato oral perdido.
Stentor coeruleus es un organismo modelo bien conocido para el estudio de la regeneración unicelular. El análisis transcriptómico de células individuales reveló cientos de genes, muchos no asociados con el aparato oral (OA), que están regulados diferencialmente en fases a lo largo del proceso de regeneración. Se planteó la hipótesis de que esta reorganización sistémica y movilización de recursos celulares hacia el crecimiento de una nueva OA conducirá a cambios observables en el movimiento y el comportamiento correspondientes en el tiempo a las fases de expresión génica diferencial. Sin embargo, la complejidad morfológica de S. coeruleus requirió el desarrollo de un ensayo para capturar las estadísticas y la escala de tiempo. Se utilizó un script personalizado para rastrear celdas en videos cortos, y se compilaron estadísticas sobre una gran población (N ~ 100). Tras la pérdida de la OA, S. coeruleus inicialmente pierde la capacidad de movimiento dirigido; luego, a partir de ~ 4 h, exhibe una caída significativa en la velocidad hasta ~ 8 h. Este ensayo proporciona una herramienta útil para el cribado de fenotipos de motilidad y puede ser adaptado para la investigación de otros organismos.
Stentor coeruleus (Stentor) es un organismo modelo bien conocido que se ha utilizado para estudiar la regeneración unicelular debido a su gran tamaño, capacidad para soportar varias técnicas microquirúrgicas y facilidad de cultivo en un entorno de laboratorio 1,2,3. Los primeros estudios de regeneración se centraron en la característica más grande y morfológicamente distinta de Stentor, la OA, que se elimina por completo tras el choque químico 4,5,6. El....
NOTA: Se cultivó una población de aproximadamente cien células de S. coeruleus de acuerdo con un protocolo JoVE8 publicado anteriormente.
1. Preparación de la muestra
El objetivo de este ensayo es cuantificar el cambio gradual de los patrones de movimiento y el aumento gradual de la velocidad de movimiento de las células dentro de una gran población de stentores regeneradores (N ~ 100). Para facilitar la interpretación de los resultados, el código personalizado incluido en este protocolo genera dos tipos de gráficos: una superposición de todos los rastros de movimiento celular en un conjunto de datos de video (Figura 1C-F
Actualmente existen muchos algoritmos de seguimiento de partículas y células, algunos completamente gratuitos. El costo y la facilidad de uso a menudo son compensaciones que requieren compromiso. Además, muchos de los programas de seguimiento celular existentes están diseñados para rastrear el movimiento lento de rastreo de las células de cultivo de tejidos, en lugar del movimiento de natación rápida de Stentor, que gira mientras nada y puede sufrir cambios repentinos de dirección. Después de probar mu.......
Este trabajo fue apoyado, en parte, por el Laboratorio de Biología Marina Whitman Early Career Fellowship (JYS). Reconocemos a Evan Burns, Mit Patel, Melanie Melo y Skylar Widman por ayudar con algunos de los análisis preliminares y las pruebas de código. Agradecemos a Mark Slabodnick por la discusión y las sugerencias. WFM reconoce el apoyo de la subvención R35 GM130327 de los NIH.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.25 mm-thick silicone sheet | Grace Bio-Labs | CWS-S-0.25 | |
24 x 50 mm, #1.5 coverglass | Fisher Scientific | NC1034527 | As noted in Discussion, smaller coverglass can be used if fewer sample wells are placed on one slide. |
CCD camera | We used Nikon D750 | ||
Chlamydomonas 137c WT strain | Chlamydomonas Resource Center | CC-125 | |
MATLAB | MATHWORKS | ||
MATLAB Image Processing Toolbox | MATHWORKS | needed for TrackCells.m and CleanTraces.m | |
MATLAB Statistics and Machine Learning Toolbox | MATHWORKS | needed for TrackCells.m | |
Microscope with camera port | We used Zeiss AxioZoom v1.6 and Leica S9E | ||
Pasteurized Spring Water | Carolina | 132458 | |
TAP Growth Media | ThermoFisher Scientific | A1379801 | Can also be made for much cheaper following recipe from Chlamy Resource Center |
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