Analys av motilitetsmönster av stentor under och efter oral apparatregenerering med hjälp av cellspårning

Vi presenterar ett protokoll för karakterisering av rörlighet och beteende hos en population av hundra mikron- till millimeterstora celler med hjälp av ljusfältmikroskopi och cellspårning. Denna analys avslöjar att Stentor coeruleus övergår genom fyra beteendemässigt distinkta faser när man regenererar en förlorad oral apparat.

Stentor coeruleus är en välkänd modellorganism för studier av encellig regenerering. Transkriptomisk analys av enskilda celler avslöjade hundratals gener - många som inte är associerade med den orala apparaten (OA) - som regleras differentiellt i faser under hela regenereringsprocessen. Det antogs att denna systemiska omorganisation och mobilisering av cellulära resurser mot tillväxt av en ny OA kommer att leda till observerbara förändringar i rörelse och beteende som i tid motsvarar faserna av differentiellt genuttryck. Den morfologiska komplexiteten hos S. coeruleus krävde emellertid utvecklingen av en analys för att fånga statistiken och tidsskalan. Ett anpassat skript användes för att spåra celler i korta videor, och statistik sammanställdes över en stor befolkning (N ~ 100). Vid förlust av OA förlorar S. coeruleus initialt förmågan till riktad rörelse; sedan börjar vid ~ 4 h, uppvisar den en betydande hastighetsminskning fram till ~ 8 h. Denna analys ger ett användbart verktyg för screening av motilitetsfenotyper och kan anpassas för undersökning av andra organismer.

Stentor coeruleus (Stentor) är en välkänd modellorganism som har använts för att studera encellig regenerering på grund av dess stora storlek, förmåga att motstå flera mikrokirurgiska tekniker och lätthet att odla i laboratoriemiljö ^1,2,3. Tidiga regenereringsstudier fokuserade på den största och mest morfologiskt distinkta egenskapen hos Stentor - OA - som kastas helt på kemisk chock ^4,5,6. De novo-ersättning av en förlorad OA börjar med framväxte....

OBS: En population av cirka hundra S. coeruleus-celler odlades i enlighet med ett tidigare publicerat JoVE-protokoll⁸.

1. Beredning av prover

1. Skär en bit 250 μm tjock silikondistansplåt (Materialtabell) något mindre i både höjd och bredd än ett mikroskopglas. Använd en 5/16 " hålslagning, skapa cirkulära brunnar. Var uppmärksam på att lämna tillräckligt med utrymme mellan angränsande brunnar för att säkerställa en br.......

Målet med denna analys är att kvantifiera den gradvisa förändringen av rörelsemönster och fasad ökning av rörelsehastigheten från celler inom en stor (N ~ 100) regenererande Stentor-population. För att underlätta tolkningen av resultaten genererar den anpassade koden som ingår i detta protokoll två typer av diagram: ett överlägg av alla cellrörelsespår i en uppsättning videodata (figur 1C-F och figur S1) och ett di.......

Många partikel- och cellspårningsalgoritmer finns för närvarande, vissa helt gratis. Kostnad och användarvänlighet är ofta avvägningar som kräver kompromisser. Dessutom är många av de befintliga cellspårningsprogrammen utformade för att spåra långsam kryprörelse av vävnadsodlingsceller, snarare än Stentors snabba simrörelse, som roterar medan du simmar och kan genomgå plötsliga riktningsförändringar. Efter att ha testat många av dessa alternativ är protokollet som presenteras här avsett.......

Detta arbete stöddes delvis av Marine Biological Laboratory Whitman Early Career Fellowship (JYS). Vi erkänner Evan Burns, Mit Patel, Melanie Melo och Skylar Widman för att ha hjälpt till med några av de preliminära analyserna och kodtesterna. Vi tackar Mark Slabodnick för diskussion och förslag. WFM erkänner stöd från NIH-bidrag R35 GM130327.