Mikroinjektion af majsplantehoppe, Peregrinus maidis, embryoner til CRISPR/Cas9 genomredigering

Majsplantehoppen, Peregrinus maidis, er et skadedyr af majs og en vektor af flere majsvirus. Tidligere publicerede metoder beskriver udløsningen af RNA-interferens (RNAi) i P. maidis gennem mikroinjektion af dobbeltstrengede RNA'er (dsRNA'er) i nymfer og voksne. På trods af kraften i RNAi er fænotyper genereret via denne teknik forbigående og mangler langsigtet Mendelsk arv. Derfor skal P. Maidis-værktøjskassen udvides til at omfatte funktionelle genomiske værktøjer, der vil muliggøre produktion af stabile mutantstammer og åbne døren for forskere til at anvende nye bekæmpelsesmetoder på dette økonomisk vigtige skadedyr. I modsætning til de dsRNA'er, der anvendes til RNAi, krydser de komponenter, der anvendes i CRISPR / Cas9-baseret genomredigering og kimlinjetransformation, imidlertid ikke let cellemembraner. Som følge heraf skal plasmid-DNA'er, RNA'er og / eller proteiner mikroinjiceres i embryoner, før embryoet cellulariseres, hvilket gør injektionstidspunktet til en kritisk faktor for succes. Til dette formål blev der udviklet en agarosebaseret æglægningsmetode, der gjorde det muligt at høste embryoner fra P. maidis-hunner med relativt korte intervaller. Heri gives detaljerede protokoller til indsamling og mikroinjektion af præcellulære P. maidis-embryoner med CRISPR-komponenter (Cas9-nuklease, der er blevet kompleksbundet med guide-RNA'er), og resultater af Cas9-baseret genknockout af et P. maidis øjenfarvegen, hvid, præsenteres. Selvom disse protokoller beskriver CRISPR/Cas9-genomredigering i P. maidis, kan de også bruges til at producere transgene P. maidis via kimlinjetransformation ved blot at ændre sammensætningen af injektionsopløsningen.