Micro-injectie van Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryo's voor CRISPR/Cas9 Genome Editing

De maïsplanthopper, Peregrinus maidis, is een plaag van maïs en een vector van verschillende maïsvirussen. Eerder gepubliceerde methoden beschrijven de triggering van RNA-interferentie (RNAi) in P. maidis door micro-injectie van dubbelstrengs RNA's (dsRNA's) in nimfen en volwassenen. Ondanks de kracht van RNAi zijn fenotypes die via deze techniek worden gegenereerd van voorbijgaande aard en missen ze langdurige Mendeliaanse overerving. Daarom moet de gereedschapskist van P. maidis worden uitgebreid met functionele genomische hulpmiddelen die de productie van stabiele mutante stammen mogelijk maken, waardoor de deur wordt geopend voor onderzoekers om nieuwe bestrijdingsmethoden in te zetten tegen deze economisch belangrijke plaag. In tegenstelling tot de dsRNA's die voor RNAi worden gebruikt, passeren de componenten die worden gebruikt in CRISPR / Cas9-gebaseerde genoombewerking en kiembaantransformatie echter niet gemakkelijk celmembranen. Als gevolg hiervan moeten plasmide-DNA's, RNA's en / of eiwitten in embryo's worden geïnjecteerd voordat het embryo cellulariseert, waardoor de timing van de injectie een kritieke factor voor succes is. Daartoe werd een op agarose gebaseerde legmethode ontwikkeld om embryo's van P. maidis-vrouwtjes met relatief korte tussenpozen te kunnen oogsten. Hierin worden gedetailleerde protocollen verstrekt voor het verzamelen en micro-injecteren van precellulaire P. maidis-embryo's met CRISPR-componenten (Cas9-nuclease dat is gecomplexeerd met gids-RNA's), en resultaten van Cas9-gebaseerde gen knock-out van een P. maidis oogkleurgen, wit, worden gepresenteerd. Hoewel deze protocollen CRISPR/Cas9-genoombewerking in P. maidis beschrijven, kunnen ze ook worden gebruikt voor het produceren van transgene P. maidis via kiembaantransformatie door simpelweg de samenstelling van de injectie-oplossing te veranderen.