מיקרו-הזרקה של תירס פלנטהופר, Peregrinus maidis, עוברים לעריכת גנום CRISPR/Cas9

צמח התירס, Peregrinus maidis, הוא מזיק של תירס ווקטור של מספר נגיפי תירס. שיטות שפורסמו בעבר מתארות את הפעלת הפרעות RNA (RNAi) ב- P. maidis באמצעות מיקרו-הזרקה של RNA דו-גדילי (dsRNAs) לנימפות ולמבוגרים. למרות כוחו של RNAi, פנוטיפים הנוצרים באמצעות טכניקה זו הם חולפים וחסרים תורשה מנדליאנית ארוכת טווח. לכן, יש להרחיב את ארגז הכלים של P. maidis כך שיכלול כלים גנומיים פונקציונליים שיאפשרו ייצור זנים מוטנטיים יציבים, ויפתחו את הדלת לחוקרים להביא שיטות הדברה חדשות למזיק חשוב מבחינה כלכלית זו. עם זאת, שלא כמו dsRNA המשמשים עבור RNAi, הרכיבים המשמשים בעריכת גנום מבוססת CRISPR/Cas9 וטרנספורמציה של קו הנבט אינם חוצים בקלות את קרום התא. כתוצאה מכך, דנ"א פלסמיד, רנ"א ו / או חלבונים חייבים להיות מוזרקים במיקרו לעוברים לפני שהעובר צלולריז, מה שהופך את תזמון ההזרקה לגורם קריטי להצלחה. לשם כך פותחה שיטת הטלת ביצים מבוססת אגרוז המאפשרת לקצור עוברים מנקבות P. maidis בפרקי זמן קצרים יחסית. להלן מוצגים פרוטוקולים מפורטים לאיסוף והזרקה זעירה של עוברי P. maidis קדם-תאיים עם רכיבי CRISPR (נוקלאז Cas9 שהורכב עם RNA מנחה), ומוצגות תוצאות של נוקאאוט גנטי מבוסס Cas9 של גן צבע עיניים P. maidis, לבן. למרות שפרוטוקולים אלה מתארים עריכת גנום CRISPR/Cas9 ב- P. maidis, הם יכולים לשמש גם לייצור P. maidis מהונדס באמצעות טרנספורמציה של קו הנבט פשוט על ידי שינוי הרכב תמיסת ההזרקה.