कैस 9 जीनोम संपादन के लिए मकई प्लांटहॉपर, पेरेग्रीनस मैडिस, भ्रूण का माइक्रोइंजेक्शन

मकई प्लांटहॉपर, पेरेग्रीनस मैडिस, मक्का का एक कीट है और कई मक्का वायरस का वेक्टर है। पहले प्रकाशित विधियों में अप्सराओं और वयस्कों में डबल-फंसे आरएनए (डीएसआरएनए) के माइक्रोइंजेक्शन के माध्यम से पी. मैडिस में आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई) के ट्रिगर का वर्णन किया गया है। आरएनएआई की शक्ति के बावजूद, इस तकनीक के माध्यम से उत्पन्न फेनोटाइप क्षणिक होते हैं और दीर्घकालिक मेंडेलियन वंशानुक्रम की कमी होती है। इसलिए, पी. मेडिस टूलबॉक्स को कार्यात्मक जीनोमिक उपकरणों को शामिल करने के लिए विस्तारित करने की आवश्यकता है जो स्थिर उत्परिवर्ती उपभेदों के उत्पादन को सक्षम करेगा, जिससे शोधकर्ताओं के लिए इस आर्थिक रूप से महत्वपूर्ण कीट पर सहन करने के लिए नए नियंत्रण विधियों को लाने के लिए दरवाजा खुल जाएगा। हालांकि, आरएनएआई के लिए उपयोग किए जाने वाले डीएसआरएनए के विपरीत, सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9-आधारित जीनोम संपादन और जर्मलाइन परिवर्तन में उपयोग किए जाने वाले घटक आसानी से कोशिका झिल्ली को पार नहीं करते हैं। नतीजतन, प्लास्मिड डीएनए, आरएनए, और / या प्रोटीन को भ्रूण सेलुलर होने से पहले भ्रूण में सूक्ष्म इंजेक्शन दिया जाना चाहिए, जिससे इंजेक्शन का समय सफलता के लिए एक महत्वपूर्ण कारक बन जाता है। उस अंत तक, अपेक्षाकृत कम अंतराल पर पी. मैडिस मादाओं से भ्रूण की कटाई की अनुमति देने के लिए एक अगारोस-आधारित अंडा-ले विधि विकसित की गई थी। इसमें सीआरआईएसपीआर घटकों (सीएएस 9 न्यूक्लियस जिसे गाइड आरएनए के साथ जटिल किया गया है) के साथ पूर्वकोशिकीय पी. मैडिस भ्रूण को एकत्र करने और माइक्रोइंजेक्ट करने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किए गए हैं, और पी. मेडिस आंख-रंग जीन, सफेद के सीएएस 9-आधारित जीन नॉकआउट के परिणाम प्रस्तुत किए गए हैं। यद्यपि ये प्रोटोकॉल पी. मैडिस में सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9-जीनोम संपादन का वर्णन करते हैं, लेकिन उनका उपयोग इंजेक्शन समाधान की संरचना को बदलकर जर्मलाइन परिवर्तन के माध्यम से ट्रांसजेनिक पी मैडिस के उत्पादन के लिए भी किया जा सकता है।