トウモロコシウンカ、 ペレグリヌスマイディス、CRISPR/Cas9ゲノム編集のための胚のマイクロインジェクション

トウモロコシのウンカ、Peregrinus maidisは、トウモロコシの害虫であり、いくつかのトウモロコシウイルスのベクターです。以前に発表された方法は、ニンフおよび成体への二本鎖RNA(dsRNA)のマイクロインジェクションによるP.maidisにおけるRNA干渉(RNAi)の誘発を説明している。RNAiの力にもかかわらず、この技術によって生成された表現型は一過性であり、長期的なメンデル遺伝を欠いています。したがって、P. maidis toolboxを拡張して、安定した変異株の生産を可能にする機能的ゲノムツールを含める必要があり、研究者がこの経済的に重要な害虫に耐える新しい防除方法をもたらすための扉を開きます。しかし、RNAiに使用されるdsRNAとは異なり、CRISPR/Cas9ベースのゲノム編集および生殖細胞系列形質転換に使用される成分は、細胞膜を容易に通過しません。その結果、胚が細胞化する前にプラスミドDNA、RNA、および/またはタンパク質を胚にマイクロインジェクションする必要があり、注入のタイミングが成功の重要な要素になります。そのために、アガロースを用いた産卵法を開発し、比較的短い間隔でP. maidis 雌から胚を採取できるようにしました。本明細書には、CRISPR成分(ガイドRNAと複合体化されたCas9ヌクレアーゼ)を有する前細胞P. maidis 胚を収集およびマイクロ注入するための詳細なプロトコルが提供され、P. maidis 目の色遺伝子である白色のCas9ベースの遺伝子ノックアウトの結果が提示される。これらのプロトコルは、P. maidisにおけるCRISPR/Cas9ゲノム編集を記述していますが、注射液の組成を変更するだけで、生殖細胞系列形質転換を介してトランスジェニックP. maidisを製造するためにも使用できます。