Микроинъекция кукурузного сеялки, Peregrinus maidis, эмбрионов для редактирования генома CRISPR/Cas9

Кукурузный сеялка, Peregrinus maidis, является вредителем кукурузы и переносчиком нескольких вирусов кукурузы. Ранее опубликованные методы описывают запуск РНК-интерференции (РНКi) у P. maidis путем микроинъекции двухцепочечных РНК (дцРНК) нимфам и взрослым особям. Несмотря на силу РНКи, фенотипы, полученные с помощью этого метода, являются преходящими и не имеют долгосрочного менделевского наследования. Таким образом, набор инструментов P. maidis необходимо расширить, включив в него функциональные геномные инструменты, которые позволили бы производить стабильные мутантные штаммы, открывая двери для исследователей, чтобы применить новые методы борьбы с этим экономически важным вредителем. Однако, в отличие от дцРНК, используемых для РНКи, компоненты, используемые при редактировании генома на основе CRISPR/Cas9 и трансформации зародышевой линии, не могут легко пересекать клеточные мембраны. В результате плазмидные ДНК, РНК и/или белки должны быть микроинъецированы в эмбрионы до того, как эмбрион станет клеточным, что делает время инъекции критическим фактором успеха. С этой целью был разработан метод откладывания яиц на основе агарозы, позволяющий собирать эмбрионы у самок P. maidis через относительно короткие промежутки времени. Приведены подробные протоколы сбора и микроинъекции прецеллюлярных эмбрионов P. maidis с компонентами CRISPR (нуклеаза Cas9, комплексообразующая с направляющими РНК), а также представлены результаты нокаута гена P. maidis на основе Cas9 гена цвета глаз P. maidis, белого цвета. Хотя эти протоколы описывают редактирование генома CRISPR/Cas9 у P. maidis, они также могут быть использованы для получения трансгенных P. maidis путем трансформации зародышевой линии путем простого изменения состава раствора для инъекций.