Storlek exkludering kromatografi för att analysera bakteriell yttre membran vesikel heterogenitet

Cellväggen av gramnegativa bakterier består av ett inre (cytoplasmiskt) och yttre membran (OM), separerat av ett tunt peptidoglykanskikt. Under hela tillväxten kan det yttre membranet bleb för att bilda sfäriska yttre membran vesiklar (OMV). Dessa OMV är involverade i många cellulära funktioner inklusive lastleverans till värdceller och kommunikation med bakterieceller. Nyligen har den terapeutiska potentialen hos OMV börjat utforskas, inklusive deras användning som vacciner och läkemedelsleveransfordon. Även om OMVs härleds från OM, har det länge uppskattats att lipid- och proteinlasten i OMV skiljer sig, ofta avsevärt, från OM. På senare tid har bevis för att bakterier kan släppa ut flera typer av OMV upptäckts, och det finns bevis för att storleken kan påverka mekanismen för deras upptag av värdceller. Studier på detta område begränsas dock av svårigheter att effektivt separera de heterogent stora omständliga oms. Densitetsgradientcentrifugation (DGC) har traditionellt använts för detta ändamål. Denna teknik är dock tidskrävande och svår att skala upp. Storleksuteslutning kromatografi (SEC), å andra sidan, är mindre besvärlig och lämpar sig för den nödvändiga framtida uppskalningen för terapeutisk användning av OMV. Här beskriver vi en SEC-metod som möjliggör reproducerbar separation av heterogent stora vesiklar, med hjälp av omvar som testfall som produceras av Aggregatibacter actinomycetemcomitans, som sträcker sig i diameter från mindre än 150 nm till större än 350 nm. Vi visar separation av "stora" (350 nm) OMV och "små" (<150 nm) OMV, verifierade av dynamisk ljusspridning (DLS). Vi rekommenderar SEC-baserade tekniker över DGC-baserade tekniker för separation av heterogent stora vesiklar på grund av dess användarvänlighet, reproducerbarhet (inklusive användar-till-användare) och möjlighet till uppskalning.