السيطرة على هندسة الخلية من خلال الأشعة تحت الحمراء الليزر بمساعدة Micropatterning

Summary

البروتوكول المعروض هنا يمكن التصنيع الآلي للخلايا الدقيقة التي توحد شكل الخلية لدراسة الهياكل الخلوية داخل خلايا الثدييات. ويمكن إنشاء هذه التقنية سهلة الاستخدام باستخدام نظم التصوير المتاحة تجاريا ولا تتطلب معدات متخصصة لا يمكن الوصول إليها في مختبرات بيولوجيا الخلايا القياسية.

Abstract

Micropatterning هو تقنية راسخة في مجتمع بيولوجيا الخلايا المستخدمة لدراسة الاتصالات بين مورفولوجيا ووظيفة المقصورات الخلوية مع التحايل على المضاعفات الناشئة عن الاختلافات الطبيعية من خلية إلى خلية. لتوحيد شكل الخلية، تقتصر الخلايا إما في قوالب ثلاثية الأبعاد أو يتم التحكم فيها للهندسة اللاصقة من خلال الجزر اللاصقة. ومع ذلك، تعتمد تقنيات التجهم المجهري التقليدية القائمة على التصوير الضوئي وحفر الأشعة فوق البنفسجية العميقة بشكل كبير على الغرف النظيفة أو المعدات المتخصصة. هنا نقدم تقنية micropatterning بمساعدة الليزر بالأشعة تحت الحمراء (microphotopatterning) المعدلة من دويل وآخرون التي يمكن إعدادها بشكل ملائم مع أنظمة التصوير المتاحة تجاريا. في هذا البروتوكول، نستخدم نظام تصوير نيكون A1R MP+ لتوليد أجهزة مجهرية بدقة ميكرون من خلال ليزر الأشعة تحت الحمراء (IR) الذي يهيج المناطق المحددة مسبقا على الأغطية المغلفة بالكحول متعدد الفينيل. نحن نستخدم سيناريو مخصص لتمكين تصنيع نمط الآلي مع كفاءة عالية ودقة في أنظمة غير مجهزة التركيز البؤري التلقائي الأجهزة. نظهر أن هذا الليزر الأشعة تحت الحمراء بمساعدة micropatterning (microphotopatterning) يؤدي البروتوكول في أنماط محددة التي تعلق الخلايا حصرا وتأخذ على الشكل المطلوب. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يكون متوسط البيانات من عدد كبير من الخلايا بسبب توحيد شكل الخلية. يمكن استخدام الأنماط الناتجة عن هذا البروتوكول ، إلى جانب التصوير عالي الدقة والتحليل الكمي ، لشاشات الإنتاجية العالية نسبيا لتحديد اللاعبين الجزيئيين الذين يتوسطون في الصلة بين الشكل والوظيفة.

Introduction

شكل الخلية هو المحدد الرئيسي للعمليات البيولوجية الأساسية مثل مورفوجينيسيس الأنسجة¹، هجرة الخلايا²، انتشار الخلايا³، والتعبير الجيني⁴. التغيرات في شكل الخلية مدفوعة بتوازن معقد بين إعادة الترتيب الديناميكي للهيكل الخلوي الذي يشوه غشاء البلازما والعوامل الخارجية مثل القوى الخارجية التي تمارس على الخلية وهندسة الالتصاقات الخلوية ومصفوفة الخلية^5. ترحيل الخلايا mesenchymal، على سبيل المثال، بلمرة شبكة أكتين كثيفة في الحافة الرائدة التي تدفع غشاء البلازما إلى الأمام ويخلق lamellipodia واسعة^6،في حين actomyosin انكماش يتراجع حافة الخ....

Protocol

1. معالجة ما قبل المعالجة في الغطاء

1. إعداد صرير نظيفة coverlips كما هو موضح في واترمان ستورر، 1998²⁵.
2. إعداد 1٪ (3-aminopropyl)trimethoxysilane (APTMS) الحل واحتضان الأغطية في الحل لمدة 10 دقيقة مع التحريض لطيف. تأكد من أن الأغطية تتحرك بحرية في الحل.
3. يغسل الأغطية مرتين مع DH₂O لمدة 5 دقا?.......

Discussion

تظهر النتائج أعلاه أن بروتوكول التجزئ المصغر بمساعدة IR الموصوف بالليزر (microphotopatterning) يوفر أنماطا قابلة للاستنساخ من مختلف الأشكال التي تمكن من التلاعب في شكل الخلية والهندسة الهيكلية الخلوية. على الرغم من أن العديد من أساليب micropatterning قد وضعت قبل وبعد ظهورها لأول مرة من microphotopatterning، هذه الط?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-Aminopropyl)trimethoxysilane	Aldrich	281778
10 cm Cell Culture Dish	VWR	10062-880	Polysterene, TC treated, vented
25X Apo LWD Water Dipping Objective	Nikon	MRD77225
3.5 cm Cell Culture Dish	VWR	10861-586	Polysterene, TC treated, vented
4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)	Thermo	62248	1mg/mL dihydrochloride solution
Bovine Serine Albumin	BioShop	ALB005
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Wisent	311-425-CL
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	E9508
Fibronectin	Sigma-Aldrich	FC010	1mg/mL in pH 7.5 buffer
Fibronectin Antibody	BD	610077	Mouse
Fiji	ImageJ		Version 1.53c
Fluorescent Phalloidin	Invitrogen	A12380	568nm
Glass Coverslip	VWR	16004-302	22 × 22 mm
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16220	25% aqueous solution
Hydrochloric Acid	Caledon	6025-1-29	37% aqueous solution
IR Laser	Coherent	Chameleon Vision
Minimal Essential Medium α	Gibco	12561-056
Mounting Medium	Sigma	F4680
Mouse Secondary Antibody	Cell Signaling Technology	4408S	Goat, 488nm
Multi-Photon Microscope	Nikon	A1R MP+
Myosin Light Chain Antibody	Cell Signaling Technology	3672S	Rabbit
NIS Elements	Nikon		Version 5.21.03
Nitric Acid	Caledon	7525-1-29	70% aqueous solution
Photoshop	Adobe		Version 21.2.1
Pluronic F-127	Sigma	P2443	Powder
Poly(vinyl alchohol)	Aldrich	341584	MW 89000-98000, 98% hydrolyzed
Rabbit Secondary Antibody	Cell Signaling Technology	4412S	Goat, 488nm
Shaker	VWR	10127-876	Alsoknown as analog rocker
Sodium Borohydride	Aldrich	452882	Powder
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma	S5136	Powder
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma	S5011	Powder
Spyder	Anaconda	4.1.4
Trypsin	Wisent	325-042-CL	0.05% aqueous solution with 0.53mM EDTA