Kontrol af cellegeometri gennem infrarød laserassisteret mikromaling

Summary

Den protokol, der præsenteres her, muliggør automatiseret fremstilling af mikropatterner, der standardiserer celleformen for at studere cytoskeletale strukturer i pattedyrsceller. Denne brugervenlige teknik kan sættes op med kommercielt tilgængelige billedbehandlingssystemer og kræver ikke specialiseret udstyr utilgængeligt for standard cellebiologiske laboratorier.

Abstract

Micropatterning er en etableret teknik i cellebiologi samfund, der anvendes til at studere forbindelser mellem morfologi og funktion af cellulære rum og samtidig omgå komplikationer som følge af naturlige celle-til-celle variationer. For at standardisere celleformen er cellerne enten begrænset i 3D-forme eller kontrolleret for klæbende geometri gennem klæbende øer. Men traditionelle mikromalingsteknikker baseret på fotolitografi og dyb UV-ætsning afhænger i høj grad af rene rum eller specialiseret udstyr. Her præsenterer vi en infrarød laser assisteret micropatterning teknik (microphotopatterning) modificeret fra Doyle et al., der kan bekvemt sættes op med kommercielt tilgængelige billedbehandlingssystemer. I denne protokol bruger vi et Nikon A1R MP+ billedsystem til at generere mikropatterner med mikronpræcision gennem en infrarød (IR) laser, der brænder forudindstillede områder på poly-vinyl alkoholbelagte coverslips. Vi anvender et brugerdefineret script til at muliggøre automatiseret mønsterfremstilling med høj effektivitet og nøjagtighed i systemer, der ikke er udstyret med en hardware autofokus. Vi viser, at denne IR laser assisteret micropatterning (microphotopatterning) protokol resulterer i definerede mønstre, som cellerne tillægger udelukkende og tage den ønskede form. Desuden kan data fra et stort antal celler beregnes som et gennemsnit på grund af standardiseringen af celleformen. Mønstre genereret med denne protokol, kombineret med høj opløsning billeddannelse og kvantitative analyser, kan bruges til relativt høje gennemløb skærme til at identificere molekylære spillere formidle forbindelsen mellem form og funktion.

Introduction

Celleform er en vigtig determinant for grundlæggende biologiske processer somf.eks^. Ændringer i celleformen er drevet af en indviklet balance mellem dynamiske omlejringer af cytoskelet, der deformerer plasmamembranen og ydre faktorer som eksterne kræfter, der udøves på cellen, og geometrien af cellecelle- og cellematrix vedhæftninger⁵. Migrerende mesenchymale celler, for eksempel, polymerisere en tæt actin netværk på forkant, der skubber plasmamembranen fremad og skaber en bred lamellipodia⁶, mens actomyosin kontraktilitet træ....

Protocol

1. Forbehandling af coverslip

1. Forbered knirkende rene coverslips som beskrevet i Waterman-Storer, 1998²⁵.
2. Forbered 1% (3-aminopropyl)trimethoxysilane (APTMS) opløsning og inkuber coverlips i opløsningen i 10 minutter med blid agitation. Sørg for, at coverslips bevæger sig frit i opløsningen.
3. Vask coverslips to gange med dH₂O i 5 min hver.
4. Forbered 0,5% glutaraldehyd (GA) opløsning og inkuber coverlips i opløsningen i 30 minutter på en shak.......

Discussion

Resultaterne ovenfor viser, at den beskrevne IR laser assisteret micropatterning (microphotopatterning) protokol giver reproducerbare vedhængende mønstre af forskellige former, der muliggør manipulation af celleform og cytoskeletal arkitektur. Selv om der er udviklet adskillige mikromalingsmetoder både før og efter debuten af mikrofotomaling, har denne metode flere fordele. For det første kræver det ikke specialiseret udstyr og renrum, der normalt kun findes inden for ingeniørafdelinger. Faktisk, som multiphoton .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-Aminopropyl)trimethoxysilane	Aldrich	281778
10 cm Cell Culture Dish	VWR	10062-880	Polysterene, TC treated, vented
25X Apo LWD Water Dipping Objective	Nikon	MRD77225
3.5 cm Cell Culture Dish	VWR	10861-586	Polysterene, TC treated, vented
4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)	Thermo	62248	1mg/mL dihydrochloride solution
Bovine Serine Albumin	BioShop	ALB005
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Wisent	311-425-CL
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	E9508
Fibronectin	Sigma-Aldrich	FC010	1mg/mL in pH 7.5 buffer
Fibronectin Antibody	BD	610077	Mouse
Fiji	ImageJ		Version 1.53c
Fluorescent Phalloidin	Invitrogen	A12380	568nm
Glass Coverslip	VWR	16004-302	22 × 22 mm
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16220	25% aqueous solution
Hydrochloric Acid	Caledon	6025-1-29	37% aqueous solution
IR Laser	Coherent	Chameleon Vision
Minimal Essential Medium α	Gibco	12561-056
Mounting Medium	Sigma	F4680
Mouse Secondary Antibody	Cell Signaling Technology	4408S	Goat, 488nm
Multi-Photon Microscope	Nikon	A1R MP+
Myosin Light Chain Antibody	Cell Signaling Technology	3672S	Rabbit
NIS Elements	Nikon		Version 5.21.03
Nitric Acid	Caledon	7525-1-29	70% aqueous solution
Photoshop	Adobe		Version 21.2.1
Pluronic F-127	Sigma	P2443	Powder
Poly(vinyl alchohol)	Aldrich	341584	MW 89000-98000, 98% hydrolyzed
Rabbit Secondary Antibody	Cell Signaling Technology	4412S	Goat, 488nm
Shaker	VWR	10127-876	Alsoknown as analog rocker
Sodium Borohydride	Aldrich	452882	Powder
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma	S5136	Powder
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma	S5011	Powder
Spyder	Anaconda	4.1.4
Trypsin	Wisent	325-042-CL	0.05% aqueous solution with 0.53mM EDTA