Controle van celgeometrie door infrarood laserondersteunde micropatterning

Summary

Het hier gepresenteerde protocol maakt geautomatiseerde fabricage van micropatterns mogelijk die de celvorm standaardiseert om cytoskeletstructuren in zoogdiercellen te bestuderen. Deze gebruiksvriendelijke techniek kan worden opgezet met in de handel verkrijgbaar beeldvormingssystemen en vereist geen gespecialiseerde apparatuur die niet toegankelijk is voor standaard celbiologielaboratoria.

Abstract

Micropatterning is een gevestigde techniek in de celbiologiegemeenschap die wordt gebruikt om verbanden tussen de morfologie en de functie van cellulaire compartimenten te bestuderen en tegelijkertijd complicaties als gevolg van natuurlijke cel-tot-celvariaties te omzeilen. Om de celvorm te standaardiseren, worden cellen ofwel opgesloten in 3D-mallen of gecontroleerd voor lijmgeometrie via kleefeilanden. Traditionele micropatterningtechnieken op basis van fotolithografie en diepe UV-etsen zijn echter sterk afhankelijk van cleanrooms of gespecialiseerde apparatuur. Hier presenteren we een infrarood laser assisted micropatterning techniek (microphotopatterning) aangepast van Doyle et al. die gemakkelijk kan worden opgezet met commercieel beschikbare beeldvormingssystemen. In dit protocol gebruiken we een Nikon A1R MP+ beeldvormingssysteem om micropatterns met micronprecisie te genereren via een infrarood (IR) laser die vooraf ingestelde gebieden op poly-vinyl alcohol gecoate coverslips in brand slaagt. We gebruiken een aangepast script om geautomatiseerde patroonfabricage met hoge efficiëntie en nauwkeurigheid mogelijk te maken in systemen die niet zijn uitgerust met een hardware autofocus. We laten zien dat dit IR laser assisted micropatterning (microphotopatterning) protocol resulteert in gedefinieerde patronen waaraan cellen zich uitsluitend hechten en de gewenste vorm aannemen. Bovendien kunnen gegevens van een groot aantal cellen worden gemiddeld vanwege de standaardisatie van de celvorm. Patronen gegenereerd met dit protocol, gecombineerd met hoge resolutie beeldvorming en kwantitatieve analyse, kunnen worden gebruikt voor schermen met een relatief hoge doorvoersnelheid om moleculaire spelers te identificeren die de link tussen vorm en functie bemiddelen.

Introduction

Celvorm is een belangrijke determinant van fundamentele biologische processen zoals weefselmorfogenese¹, celmigratie², celproliferatie³en genexpressie⁴. Veranderingen in celvorm worden gedreven door een ingewikkelde balans tussen dynamische herschikkingen van het cytoskelet dat het plasmamembraan vervormt en extrinsieke factoren zoals externe krachten die op de cel worden uitgeoefend en de geometrie van celcel- en celmatrixadhesie⁵. Migrerende mesenchymale cellen polymeriseren bijvoorbeeld een dicht actinenetwerk aan de voorrand dat het plasmamembraa....

Protocol

1. Coverslip voorbewerking

1. Bereid piepende schone coverslips voor zoals beschreven in Waterman-Storer, 1998²⁵.
2. Bereid 1% (3-aminopropyl)trimethoxysilane (APTMS) oplossing en incubeer de deklips in de oplossing gedurende 10 minuten met zachte agitatie. Zorg ervoor dat de afdeklips vrij in de oplossing bewegen.
3. Was de afdeklips tweemaal met dH₂O gedurende elk 5 min.
4. Bereid 0,5% glutaraldehyde (GA) oplossing en incubeer de deklipjes in de oplossing g.......

Discussion

De bovenstaande resultaten tonen aan dat het beschreven IR-laserondersteunde micropatterning (microfotopatterning) protocol reproduceerbare aanhangpatronen van verschillende vormen biedt die de manipulatie van celvorm en cytoskeletarchitectuur mogelijk maken. Hoewel er zowel voor als na het debuut van microphotopatterning tal van micropatterningmethoden zijn ontwikkeld, heeft deze methode verschillende voordelen. Ten eerste vereist het geen gespecialiseerde apparatuur en cleanrooms die meestal alleen binnen engineeringaf.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-Aminopropyl)trimethoxysilane	Aldrich	281778
10 cm Cell Culture Dish	VWR	10062-880	Polysterene, TC treated, vented
25X Apo LWD Water Dipping Objective	Nikon	MRD77225
3.5 cm Cell Culture Dish	VWR	10861-586	Polysterene, TC treated, vented
4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)	Thermo	62248	1mg/mL dihydrochloride solution
Bovine Serine Albumin	BioShop	ALB005
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Wisent	311-425-CL
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	E9508
Fibronectin	Sigma-Aldrich	FC010	1mg/mL in pH 7.5 buffer
Fibronectin Antibody	BD	610077	Mouse
Fiji	ImageJ		Version 1.53c
Fluorescent Phalloidin	Invitrogen	A12380	568nm
Glass Coverslip	VWR	16004-302	22 × 22 mm
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16220	25% aqueous solution
Hydrochloric Acid	Caledon	6025-1-29	37% aqueous solution
IR Laser	Coherent	Chameleon Vision
Minimal Essential Medium α	Gibco	12561-056
Mounting Medium	Sigma	F4680
Mouse Secondary Antibody	Cell Signaling Technology	4408S	Goat, 488nm
Multi-Photon Microscope	Nikon	A1R MP+
Myosin Light Chain Antibody	Cell Signaling Technology	3672S	Rabbit
NIS Elements	Nikon		Version 5.21.03
Nitric Acid	Caledon	7525-1-29	70% aqueous solution
Photoshop	Adobe		Version 21.2.1
Pluronic F-127	Sigma	P2443	Powder
Poly(vinyl alchohol)	Aldrich	341584	MW 89000-98000, 98% hydrolyzed
Rabbit Secondary Antibody	Cell Signaling Technology	4412S	Goat, 488nm
Shaker	VWR	10127-876	Alsoknown as analog rocker
Sodium Borohydride	Aldrich	452882	Powder
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma	S5136	Powder
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma	S5011	Powder
Spyder	Anaconda	4.1.4
Trypsin	Wisent	325-042-CL	0.05% aqueous solution with 0.53mM EDTA