Contrôle de la géométrie cellulaire par micropatterning assisté par laser infrarouge

Résumé

Le protocole présenté ici permet la fabrication automatisée de micropatterns qui normalisent la forme des cellules pour étudier les structures cytosquelettiques dans les cellules de mammifères. Cette technique conviviale peut être mise en place avec des systèmes d’imagerie disponibles dans le commerce et ne nécessite pas d’équipement spécialisé inaccessible aux laboratoires de biologie cellulaire standard.

Résumé

Le micropatterning est une technique établie dans la communauté de la biologie cellulaire utilisée pour étudier les liens entre la morphologie et la fonction des compartiments cellulaires tout en contournant les complications découlant des variations naturelles de cellule à cellule. Pour normaliser la forme des cellules, les cellules sont soit confinées dans des moules 3D, soit contrôlées pour la géométrie adhésive à travers des îlots adhésifs. Cependant, les techniques traditionnelles de micropatternage basées sur la photolithographie et la gravure uv profonde dépendent fortement des salles blanches ou de l’équipement spécialisé. Nous présentons ici une technique de micropatterning assistée par laser infrarouge (microphotopatterning) modifiée à partir de Doyle et al. qui peut être facilement configurée avec des systèmes d’imagerie disponibles dans le commerce. Dans ce protocole, nous utilisons un système d’imagerie Nikon A1R MP+ pour générer des micropatterns avec une précision de micron grâce à un laser infrarouge (IR) qui abrexage les régions prédéfinies sur des lamules recouvertes d’alcool poly vinylique. Nous utilisons un script personnalisé pour permettre la fabrication automatisée de motifs avec une efficacité et une précision élevées dans les systèmes non équipés d’une mise au point automatique matérielle. Nous montrons que ce protocole de micropatterning assisté par laser IR (microphotopatterning) se traduit par des motifs définis auxquels les cellules se fixent exclusivement et prennent la forme souhaitée. En outre, les données d’un grand nombre de cellules peuvent être moyennales en raison de la normalisation de la forme des cellules. Les modèles générés avec ce protocole, combinés à l’imagerie haute résolution et à l’analyse quantitative, peuvent être utilisés pour des écrans à débit relativement élevé afin d’identifier les lecteurs moléculaires médiant le lien entre la forme et la fonction.

Introduction

La forme cellulaire est un déterminant clé des processus biologiques fondamentaux tels que la morphogenèse tissulaire^1,la migration cellulaire^2,la prolifération cellulaire³et l’expression^{génique 4.} Les changements de forme cellulaire sont entraînés par un équilibre complexe entre les réarrangements dynamiques du cytosquelette qui déforme la membrane plasmique et les facteurs extrinsèques tels que les forces externes exercées sur la cellule et la géométrie des adhérences cellule-cellule et cellule-matrice^5. Les cellules mésenchymateuses migratrices, p....

Protocole

1. Prétraitement de coverslip

1. Préparer des lamelle de couverture propre et grinçante comme décrit dans Waterman-Storer, 1998²⁵.
2. Préparer la solution à 1% de (3-aminopropyl)triméthoxysilane (APTMS) et incuber les lamaux dans la solution pendant 10 min avec une agitation douce. Assurez-vous que les lamelle se déplacent librement dans la solution.
3. Laver les lamelle deux fois avec dH₂O pendant 5 min chacune.
4. Préparer une solution de glutaraldéhyde (GA) à 0,5 % et incuber les lamaux de couverture dans la solution pendant 30 min sur un agitateur. Pour 25 lamaux de couverture, utilisez 50 mL de soluti....

Résultats

La qualité des données expérimentales obtenues par micropatterning dépend en grande partie de la qualité des modèles. Pour déterminer la qualité des motifs générés avec la méthode ci-dessus, nous avons d’abord utilisé la microscopie à réflectance pour évaluer la forme et la taille des zones photo-ablées de la lame de couverture. Nous avons constaté que chaque motif individuel ressemblait beaucoup au masque d’ablation et présentait des pensionnaires clairs et une surface qui réfléchissait uniform?.......

Discussion

Les résultats ci-dessus démontrent que le protocole de micropatterning (microphotopatterning) assisté par laser IR décrit fournit des modèles adhérents reproductibles de diverses formes qui permettent la manipulation de la forme cellulaire et de l’architecture cytosquelettique. Bien que de nombreuses méthodes de micropatterning aient été développées avant et après les débuts du microphotopatterning, cette méthode présente plusieurs avantages. Tout d’abord, il ne nécessite pas d’équipement spéciali.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-Aminopropyl)trimethoxysilane	Aldrich	281778
10 cm Cell Culture Dish	VWR	10062-880	Polysterene, TC treated, vented
25X Apo LWD Water Dipping Objective	Nikon	MRD77225
3.5 cm Cell Culture Dish	VWR	10861-586	Polysterene, TC treated, vented
4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)	Thermo	62248	1mg/mL dihydrochloride solution
Bovine Serine Albumin	BioShop	ALB005
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Wisent	311-425-CL
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	E9508
Fibronectin	Sigma-Aldrich	FC010	1mg/mL in pH 7.5 buffer
Fibronectin Antibody	BD	610077	Mouse
Fiji	ImageJ		Version 1.53c
Fluorescent Phalloidin	Invitrogen	A12380	568nm
Glass Coverslip	VWR	16004-302	22 × 22 mm
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16220	25% aqueous solution
Hydrochloric Acid	Caledon	6025-1-29	37% aqueous solution
IR Laser	Coherent	Chameleon Vision
Minimal Essential Medium α	Gibco	12561-056
Mounting Medium	Sigma	F4680
Mouse Secondary Antibody	Cell Signaling Technology	4408S	Goat, 488nm
Multi-Photon Microscope	Nikon	A1R MP+
Myosin Light Chain Antibody	Cell Signaling Technology	3672S	Rabbit
NIS Elements	Nikon		Version 5.21.03
Nitric Acid	Caledon	7525-1-29	70% aqueous solution
Photoshop	Adobe		Version 21.2.1
Pluronic F-127	Sigma	P2443	Powder
Poly(vinyl alchohol)	Aldrich	341584	MW 89000-98000, 98% hydrolyzed
Rabbit Secondary Antibody	Cell Signaling Technology	4412S	Goat, 488nm
Shaker	VWR	10127-876	Alsoknown as analog rocker
Sodium Borohydride	Aldrich	452882	Powder
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma	S5136	Powder
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma	S5011	Powder
Spyder	Anaconda	4.1.4
Trypsin	Wisent	325-042-CL	0.05% aqueous solution with 0.53mM EDTA