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Le protocole présenté ici permet la fabrication automatisée de micropatterns qui normalisent la forme des cellules pour étudier les structures cytosquelettiques dans les cellules de mammifères. Cette technique conviviale peut être mise en place avec des systèmes d’imagerie disponibles dans le commerce et ne nécessite pas d’équipement spécialisé inaccessible aux laboratoires de biologie cellulaire standard.
Le micropatterning est une technique établie dans la communauté de la biologie cellulaire utilisée pour étudier les liens entre la morphologie et la fonction des compartiments cellulaires tout en contournant les complications découlant des variations naturelles de cellule à cellule. Pour normaliser la forme des cellules, les cellules sont soit confinées dans des moules 3D, soit contrôlées pour la géométrie adhésive à travers des îlots adhésifs. Cependant, les techniques traditionnelles de micropatternage basées sur la photolithographie et la gravure uv profonde dépendent fortement des salles blanches ou de l’équipement spécialisé. Nous présentons ici une technique de micropatterning assistée par laser infrarouge (microphotopatterning) modifiée à partir de Doyle et al. qui peut être facilement configurée avec des systèmes d’imagerie disponibles dans le commerce. Dans ce protocole, nous utilisons un système d’imagerie Nikon A1R MP+ pour générer des micropatterns avec une précision de micron grâce à un laser infrarouge (IR) qui abrexage les régions prédéfinies sur des lamules recouvertes d’alcool poly vinylique. Nous utilisons un script personnalisé pour permettre la fabrication automatisée de motifs avec une efficacité et une précision élevées dans les systèmes non équipés d’une mise au point automatique matérielle. Nous montrons que ce protocole de micropatterning assisté par laser IR (microphotopatterning) se traduit par des motifs définis auxquels les cellules se fixent exclusivement et prennent la forme souhaitée. En outre, les données d’un grand nombre de cellules peuvent être moyennales en raison de la normalisation de la forme des cellules. Les modèles générés avec ce protocole, combinés à l’imagerie haute résolution et à l’analyse quantitative, peuvent être utilisés pour des écrans à débit relativement élevé afin d’identifier les lecteurs moléculaires médiant le lien entre la forme et la fonction.
La forme cellulaire est un déterminant clé des processus biologiques fondamentaux tels que la morphogenèse tissulaire1,la migration cellulaire2,la prolifération cellulaire3et l’expressiongénique 4. Les changements de forme cellulaire sont entraînés par un équilibre complexe entre les réarrangements dynamiques du cytosquelette qui déforme la membrane plasmique et les facteurs extrinsèques tels que les forces externes exercées sur la cellule et la géométrie des adhérences cellule-cellule et cellule-matrice5. Les cellules mésenchymateuses migratrices, par exemple, polymérisent un réseau dense d’actine au bord d’attaque qui pousse la membrane plasmique vers l’avant et crée une large lamellipodie6,tandis que la contractilité de l’actomyosine rétracte le bord de fuite étroit de la cellule pour détacher la cellule de sa position actuelle7,8. Perturber les événements de signalisation qui donnent lieu à de telles structures cytosquelettiques spécialisées perturbe la forme et la polarité et ralentit la migration cellulaire9. En outre, la flexion de la feuille épithéliale pendant la gastrulation nécessite une constriction apicale à base d’actomyosine qui provoque la flexion des cellules et de leurs voisins en forme de coin10. Bien que ces études soulignent l’importance de la forme cellulaire, l’hétérogénéité inhérente à la forme cellulaire a entravé les efforts visant à identifier les mécanismes qui relient la morphologie à la fonction.
À cette fin, de nombreuses approches pour manipuler la forme des cellules ont été développées au cours des trois dernières décennies. Ces approches atteignent leur objectif soit en contraignant la cellule avec un moule tridimensionnel, soit en contrôlant la géométrie d’adhésion cellulaire par dépôt à motifs de protéines de matrice extracellulaire (ECM) sur une surface antisalissure, une technique appelée micropatterning11. Ici, nous allons passer en revue un certain nombre de techniques qui ont gagné en popularité au fil des ans.
À l’origine pionnière en tant qu’approche pour les applications microélectroniques, l’impression par microcontact à base de lithographie douce est devenue sans équivoque un favori culte12. Une plaquette maîtresse est d’abord fabriquée en exposant sélectivement des zones d’un substrat de silicium revêtu de photorésine à la photoirradiation, laissant derrière elle une surface à motifs13. Un élastomère, tel que PDMS, est ensuite versé sur la plaquette maîtresse pour générer un « tampon » doux qui transfère les protéines ECM vers un substrat désiré11,14. Une fois fabriquée, une plaquette maîtresse peut être utilisée pour couler de nombreux timbres PDMS qui donnent lieu à des micropatterns hautement reproductibles12. Cependant, les motifs ne peuvent pas être facilement ajustés en raison du long processus de photolithographie. Ce processus nécessite également un équipement hautement spécialisé et des salles blanches qui ne sont généralement pas disponibles dans les départements de biologie.
Plus récemment, il a été rapporté que l’impression directe à l’aide d’UV profonds contournait les limitations posées par les approches traditionnelles basées sur la lithographie. La lumière UV profonde est dirigée à travers un photomasque vers des zones sélectives d’une lamelle de verre recouverte de poly-L-lysine-greffé-polyéthylène glycol. Les groupes chimiques exposés aux UV profonds sont photoconvertis sans l’utilisation de linkers photosensibles pour permettre la liaison des protéines ECM15. L’absence de linkers photosensibles permet aux lamisses à motifs de rester stables à température ambiante pendant plus de sept mois15. Cette méthode évite l’utilisation de salles blanches et d’équipement de photolithographie et nécessite une formation moins spécialisée. Cependant, l’exigence de photomasques pose toujours un obstacle important pour les expériences qui nécessitent des changements facilement disponibles dans les modèles.
En plus des méthodes qui manipulent la géométrie cellulaire par le dépôt contrôlé de protéines ECM sur une surface 2D, d’autres cherchent à contrôler la forme des cellules en enfermant les cellules dans des microstructures 3D. De nombreuses études ont adapté l’approche basée sur la lithographie douce décrite ci-dessus pour générer des chambres PDMS 3D, plutôt que 2D, afin d’étudier les processus biologiques dépendant de la forme chez les embryons, les bactéries, les levures et les plantes16,17,18,19. La polymérisation à deux photons (2PP) a également pris les devants en tant que technique de microfabrication qui peut créer des échafaudages d’hydrogel 3D complexes avec une résolution nanométriquede 20. 2PP s’appuie sur les principes de l’adsorption à deux photons, où deux photons délivrés en impulsions femtosecondes sont absorbés simultanément par une molécule - photoinitiateur dans ce cas - qui permet la polymérisation locale des photopolymères21. Cette technique a été fortement utilisée pour imprimer des échafaudages 3D qui imitent les structures ECM natives du tissu humain et a été montré pour induire de faibles dommages photochimiques aux cellules22.
Les débuts du microphotopatterning il y a 10 ans ont donné aux chercheurs l’occasion de fabriquer des micropatterns tout en évitant les équipements inaccessibles et spécialisés. Le microphotopatterning crée des motifs à l’échelle du micron en éliminant thermiquement les régions sélectives d’alcool poly-vinylique (PVA) recouvertes de surfaces en verre activées à l’aide d’un laser infrarouge23,24. Les protéines ECM qui ne fixent que la surface du verre sous-jacent et non le PVA servent alors de repères biochimiques pour permettre une dynamique de propagation contrôlée et la forme des cellules. Cette méthode offre également une flexibilité supérieure car les modèles peuvent être facilement modifiés en temps réel. Ici, nous fournissons un protocole étape par étape de microphotopatterning en utilisant un système d’imagerie multi-photons commercial. Le protocole décrit est conçu pour la fabrication rapide et automatisée de grands motifs. Nous avons démontré que ces modèles contrôlent efficacement la forme des cellules en limitant la géométrie des adhérences cellule-ECM. En conclusion, nous démontrons que la technique de modelage décrite module l’organisation et la dynamique du cytosquelette d’actine.
1. Prétraitement de coverslip
2. Revêtement PVA
3. Configuration du microscope multiphotonique
REMARQUE: Le protocole décrit est réglé pour créer des micropatterns adhésifs cellulaires de la forme et de la taille souhaitées sur les systèmes d’imagerie multi-photons droits ou inversés, en particulier ceux qui ne sont pas équipés d’une mise au point automatique matérielle. Ainsi, pour chaque champ de vision (FOV), le script de motif abrége une petite zone pour créer un marqueur fiduciaire sur la lame de couverture, utilise une mise au point automatique logicielle pour concentrer le microscope sur la surface de la lame de couverture et alate le motif souhaité. L’exécution de ce script dans une boucle pour les FOVs adjacents crée de manière robuste un large éventail de micropatterns (5 x 5 mm ou plus) qui contraignent la forme des cellules et modulent l’activité des processus biologiques intracellulaires. Le protocole décrit a été développé pour le système d’imagerie Nikon A1R MP+ contrôlé par le logiciel NIS-Elements. Si un système d’imagerie d’un autre fournisseur est utilisé pour la répétition, les configurations optiques et le script de modelage doivent être ajustés conformément aux instructions du fabricant.
4. Génération du masque de retour sur investissement et configuration de la macro
5. Génération de micropatterns à l’aide de la photo-ablation
6. Adsorption de la fibronectine
7. Attachement de cellule
REMARQUE: Le protocole suivant est optimisé pour les fibroblastes gingivaux humains primaires.
8. Acquisition de données
9. Analyse d’image
REMARQUE: Le protocole suivant permet aux utilisateurs d’obtenir le signal de fluorescence moyen de la protéine d’intérêt sur un grand nombre de cellules à partir de piles Z d’images de microscope.
La qualité des données expérimentales obtenues par micropatterning dépend en grande partie de la qualité des modèles. Pour déterminer la qualité des motifs générés avec la méthode ci-dessus, nous avons d’abord utilisé la microscopie à réflectance pour évaluer la forme et la taille des zones photo-ablées de la lame de couverture. Nous avons constaté que chaque motif individuel ressemblait beaucoup au masque d’ablation et présentait des pensionnaires clairs et une surface qui réfléchissait uniform?...
Les résultats ci-dessus démontrent que le protocole de micropatterning (microphotopatterning) assisté par laser IR décrit fournit des modèles adhérents reproductibles de diverses formes qui permettent la manipulation de la forme cellulaire et de l’architecture cytosquelettique. Bien que de nombreuses méthodes de micropatterning aient été développées avant et après les débuts du microphotopatterning, cette méthode présente plusieurs avantages. Tout d’abord, il ne nécessite pas d’équipement spéciali...
Les auteurs ne révèlent aucun conflit d’intérêts.
Ces travaux ont été appuyés par la Bourse de nouveau chercheur du Fonds Connaught à S.P., la Fondation canadienne pour l’innovation, le Programme de subventions à la découverte du CRSNG (subventions RGPIN-2015-05114 et RGPIN-2020-05881), le Fonds conjoint de recherche de l’Université de Manchester et de l’Université de Toronto et le programme XSeed de l’Université de Toronto. C.T. a été appuyé par une bourse de recherche de l’USRA du CRSNG.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
(3-Aminopropyl)trimethoxysilane | Aldrich | 281778 | |
10 cm Cell Culture Dish | VWR | 10062-880 | Polysterene, TC treated, vented |
25X Apo LWD Water Dipping Objective | Nikon | MRD77225 | |
3.5 cm Cell Culture Dish | VWR | 10861-586 | Polysterene, TC treated, vented |
4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) | Thermo | 62248 | 1mg/mL dihydrochloride solution |
Bovine Serine Albumin | BioShop | ALB005 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Wisent | 311-425-CL | |
Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | |
Fibronectin | Sigma-Aldrich | FC010 | 1mg/mL in pH 7.5 buffer |
Fibronectin Antibody | BD | 610077 | Mouse |
Fiji | ImageJ | Version 1.53c | |
Fluorescent Phalloidin | Invitrogen | A12380 | 568nm |
Glass Coverslip | VWR | 16004-302 | 22 × 22 mm |
Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16220 | 25% aqueous solution |
Hydrochloric Acid | Caledon | 6025-1-29 | 37% aqueous solution |
IR Laser | Coherent | Chameleon Vision | |
Minimal Essential Medium α | Gibco | 12561-056 | |
Mounting Medium | Sigma | F4680 | |
Mouse Secondary Antibody | Cell Signaling Technology | 4408S | Goat, 488nm |
Multi-Photon Microscope | Nikon | A1R MP+ | |
Myosin Light Chain Antibody | Cell Signaling Technology | 3672S | Rabbit |
NIS Elements | Nikon | Version 5.21.03 | |
Nitric Acid | Caledon | 7525-1-29 | 70% aqueous solution |
Photoshop | Adobe | Version 21.2.1 | |
Pluronic F-127 | Sigma | P2443 | Powder |
Poly(vinyl alchohol) | Aldrich | 341584 | MW 89000-98000, 98% hydrolyzed |
Rabbit Secondary Antibody | Cell Signaling Technology | 4412S | Goat, 488nm |
Shaker | VWR | 10127-876 | Alsoknown as analog rocker |
Sodium Borohydride | Aldrich | 452882 | Powder |
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | S5136 | Powder |
Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S5011 | Powder |
Spyder | Anaconda | 4.1.4 | |
Trypsin | Wisent | 325-042-CL | 0.05% aqueous solution with 0.53mM EDTA |
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