इन्फ्रारेड लेजर असिस्टेड माइक्रोपैटर्निंग के माध्यम से सेल ज्यामिति का नियंत्रण

Summary

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल माइक्रोपैटर्न के स्वचालित निर्माण को सक्षम बनाता है जो स्तनधारी कोशिकाओं के भीतर साइटोस्केलेटल संरचनाओं का अध्ययन करने के लिए सेल आकार का मानकीकरण करता है। इस उपयोगकर्ता के अनुकूल तकनीक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध इमेजिंग सिस्टम के साथ स्थापित किया जा सकता है और मानक सेल जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं के लिए दुर्गम विशेष उपकरणों की आवश्यकता नहीं है ।

Abstract

माइक्रोपैटर्निंग सेल बायोलॉजी समुदाय में एक स्थापित तकनीक है जो प्राकृतिक सेल-टू-सेल विविधताओं से उत्पन्न जटिलताओं को दरकिनार करते हुए सेलुलर डिब्बों के आकृति विज्ञान और कार्य के बीच कनेक्शन का अध्ययन करने के लिए उपयोग की जाती है। कोशिका आकार को मानकीकृत करने के लिए, कोशिकाएं या तो 3 डी मोल्डों में सीमित होती हैं या चिपकने वाले द्वीपों के माध्यम से चिपकने वाली ज्यामिति के लिए नियंत्रित होती हैं। हालांकि, फोटोलिथोग्राफी और डीप यूवी नक़्क़ाशी पर आधारित पारंपरिक माइक्रोपैटर्निंग तकनीक साफ कमरे या विशेष उपकरणों पर निर्भर करती है। यहां हम डॉयल एट अल से संशोधित एक अवरक्त लेजर असिस्टेड माइक्रोपैटर्निंग तकनीक (माइक्रोफोटोपैटरिंग) पेश करते हैं जिसे आसानी से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध इमेजिंग सिस्टम के साथ स्थापित किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में, हम एक निकॉन A1R एमपी + इमेजिंग सिस्टम का उपयोग एक अवरक्त (आईआर) लेजर के माध्यम से माइक्रोपैटर्न के साथ माइक्रोपैटर्न उत्पन्न करने के लिए करते हैं जो पॉली-विनाइल अल्कोहल कोटेड कवर्लिप्स पर पूर्व निर्धारित क्षेत्रों को अलग करता है। हम हार्डवेयर ऑटोफोकस से लैस सिस्टम में उच्च दक्षता और सटीकता के साथ स्वचालित पैटर्न निर्माण को सक्षम करने के लिए एक कस्टम स्क्रिप्ट को नियोजित करते हैं। हम बताते हैं कि इस आईआर लेजर असिस्टेड माइक्रोपैटरिंग (माइक्रोफोटोपैटरिंग) प्रोटोकॉल के परिणामस्वरूप परिभाषित पैटर्न होते हैं जो कोशिकाएं विशेष रूप से संलग्न होती हैं और वांछित आकार लेती हैं। इसके अलावा, कोशिकाओं के आकार के मानकीकरण के कारण बड़ी संख्या में कोशिकाओं से डेटा का औसत किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल के साथ उत्पन्न पैटर्न, उच्च रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग और मात्रात्मक विश्लेषण के साथ संयुक्त, अपेक्षाकृत उच्च थ्रूपुट स्क्रीन के लिए उपयोग किया जा सकता है ताकि फॉर्म और फ़ंक्शन के बीच लिंक की मध्यस्थता करने वाले आणविक खिलाड़ियों की पहचान की जा सके।

Introduction

कोशिका का आकार ऊतक मॉर्फोजेनेसिस¹, सेल माइग्रेशन², सेल प्रसार 3 और जीन अभिव्यक्ति⁴जैसी मौलिक जैविक प्रक्रियाओं का एक प्रमुख निर्धारक है । कोशिका के आकार में परिवर्तन साइटोस्केलेटन के गतिशील पुनर्व्यवस्थाओं के बीच एक जटिल संतुलन से प्रेरित होते हैं जो प्लाज्मा झिल्ली और बाह्य कारकों जैसे कोशिका पर लगाए गए बाहरी बलों और सेल-सेल और सेल-मैट्रिक्स आसंजन⁵की ज्यामिति को विकृत करता है। उदाहरण के लिए, मेसेंचिमल कोशिकाओं को माइग्रेट करना, अग्रणी किनारे पर एक घने ऐक्टिन नेटवर्क को पॉलीमराइज करें जो प्लाज्मा झिल्ली को आगे बढ़ाता है और एक विस्तृत लैमेलिपोडिया

Protocol

1. कवरस्लिप प्रीप्रोसेसिंग

1. वाटरमैन-स्टोरर, 1998²⁵में वर्णित चीख़-साफ कवरस्लिप तैयार करें।
2. 1% (3-अमीनोप्रोपिल) ट्राइमेथॉक्सीलेन (एपीटीएमएस) समाधान तैयार करें और कोमल आंदोलन के साथ 10 मिनट के ल?.......

Discussion

ऊपर दिए गए परिणाम प्रदर्शित करते हैं कि वर्णित आईआर लेजर असिस्टेड माइक्रोपैटर्निंग (माइक्रोफोटोपैटर्निंग) प्रोटोकॉल विभिन्न आकृतियों के प्रजनन योग्य अनुयायी पैटर्न प्रदान करता है जो सेल आकार और सा.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-Aminopropyl)trimethoxysilane	Aldrich	281778
10 cm Cell Culture Dish	VWR	10062-880	Polysterene, TC treated, vented
25X Apo LWD Water Dipping Objective	Nikon	MRD77225
3.5 cm Cell Culture Dish	VWR	10861-586	Polysterene, TC treated, vented
4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)	Thermo	62248	1mg/mL dihydrochloride solution
Bovine Serine Albumin	BioShop	ALB005
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Wisent	311-425-CL
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	E9508
Fibronectin	Sigma-Aldrich	FC010	1mg/mL in pH 7.5 buffer
Fibronectin Antibody	BD	610077	Mouse
Fiji	ImageJ		Version 1.53c
Fluorescent Phalloidin	Invitrogen	A12380	568nm
Glass Coverslip	VWR	16004-302	22 × 22 mm
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16220	25% aqueous solution
Hydrochloric Acid	Caledon	6025-1-29	37% aqueous solution
IR Laser	Coherent	Chameleon Vision
Minimal Essential Medium α	Gibco	12561-056
Mounting Medium	Sigma	F4680
Mouse Secondary Antibody	Cell Signaling Technology	4408S	Goat, 488nm
Multi-Photon Microscope	Nikon	A1R MP+
Myosin Light Chain Antibody	Cell Signaling Technology	3672S	Rabbit
NIS Elements	Nikon		Version 5.21.03
Nitric Acid	Caledon	7525-1-29	70% aqueous solution
Photoshop	Adobe		Version 21.2.1
Pluronic F-127	Sigma	P2443	Powder
Poly(vinyl alchohol)	Aldrich	341584	MW 89000-98000, 98% hydrolyzed
Rabbit Secondary Antibody	Cell Signaling Technology	4412S	Goat, 488nm
Shaker	VWR	10127-876	Alsoknown as analog rocker
Sodium Borohydride	Aldrich	452882	Powder
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma	S5136	Powder
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma	S5011	Powder
Spyder	Anaconda	4.1.4
Trypsin	Wisent	325-042-CL	0.05% aqueous solution with 0.53mM EDTA