赤外線レーザー支援マイクロパターンによる細胞形状の制御

Summary

ここで示すプロトコルは、哺乳類細胞内の細胞骨格構造を研究するために細胞形状を標準化するマイクロパターンの自動製作を可能にする。このユーザーフレンドリーな技術は市販のイメージ投射システムと設定することができ、標準的な細胞生物学の実験室にアクセスできない専門の装置を要求しない。

Abstract

マイクロパターニングは、自然な細胞間変動から生じる合併症を回避しながら、細胞コンパートメントの形態と機能の間の関係を研究するために使用される細胞生物学コミュニティで確立された技術です。細胞形状を標準化するために、セルは3D金型に閉じ込められるか、接着的な島を通して接着幾何学のために制御されます。しかし、フォトリソグラフィとディープUVエッチングに基づく従来のマイクロパターニング技術は、クリーンルームや特殊な設備に大きく依存しています。ここでは、市販の撮像システムで簡便に設定できる、ドイルらから改変された赤外線レーザー支援マイクロパターン化技術(マイクロフォトパターン化)を提示する。このプロトコルでは、ニコンA1R MP+イメージングシステムを使用して、ポリビニルアルコールコーティングカバーリップ上のプリセット領域をアブラプターする赤外線(IR)レーザーを介してミクロン精度のマイクロパターンを生成します。ハードウェアオートフォーカスを搭載していないシステムでは、高効率かつ精度の高いパターン製作を可能にするカスタムスクリプトを採用しています。我々は、このIRレーザー支援マイクロパターン化(マイクロフォトパターン化)プロトコルが、細胞が排他的に取り付け、所望の形状を取る定義されたパターンをもたらすことを示す。さらに、セル形状の標準化により、多数の細胞からのデータを平均化することができる。このプロトコルで生成されたパターンは、高解像度のイメージングと定量分析と組み合わせて、比較的高いスループット画面に使用して、形態と機能の間のリンクを媒介する分子プレーヤーを識別することができます。

Introduction

細胞形状は、組織形態形成^1、細胞遊び出し^2、細胞増殖^3、遺伝子発現⁴などの基本的な生物学的プロセスの重要な決定因子である。細胞形状の変化は、細胞膜を変形させる細胞骨格の動的再配置と、細胞に及ぶ外力などの外的要因と、細胞細胞および細胞マトリックス接着の幾何学的形状との間の複雑なバランスによって駆動^される。例えば、間葉系細胞の移動は、血漿膜を前方に押し出し、広いラメリポディア⁶を作成する先端に密なアクチンネットワークを重合し、アクトミオシン収縮は細胞の狭い後縁を引き込んで現在位置^7,8から細胞を取り外^す。このような特殊な細胞骨格構造を摂動するようなシグナル伝達事象を破壊し、細胞の移動を遅くする^9.また、胃の中での上皮シートの曲げには、細胞とその隣人がくさび状^の10になる原因となるアクトミオシンベースの尖語狭窄が必要です。これらの研究は細胞形状の重要性を強調しているが、細胞形状の固有の不均一性は、形態を機能に結びつけるメカニズムを特定する努力を....

Protocol

1. カバースリップ前処理

1. ウォーターマンストア、1998²⁵に記載されているようにキーキークリーンなカバーリップを準備します。
2. 1%(3-アミノプロピル)トリメトキシシラン(APTMS)溶液を調製し、穏やかな攪拌で10分間溶液中のカバーリップをインキュベートします。カバーリップがソリューション内で自由に動かされることを確認します。
3. カバーリップをd.......

Discussion

上記の結果は、記述されたIRレーザー支援マイクロパターン化(マイクロフォトパターン化)プロトコルが、細胞形状および細胞骨格アーキテクチャの操作を可能にする様々な形状の再現可能な付着パターンを提供することを示している。マイクロフォトパターニングのデビュー前と後の両方で多くのマイクロパターン化法が開発されてきたが、この方法には複数の利点がある。第一に、通常は.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-Aminopropyl)trimethoxysilane	Aldrich	281778
10 cm Cell Culture Dish	VWR	10062-880	Polysterene, TC treated, vented
25X Apo LWD Water Dipping Objective	Nikon	MRD77225
3.5 cm Cell Culture Dish	VWR	10861-586	Polysterene, TC treated, vented
4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)	Thermo	62248	1mg/mL dihydrochloride solution
Bovine Serine Albumin	BioShop	ALB005
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Wisent	311-425-CL
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	E9508
Fibronectin	Sigma-Aldrich	FC010	1mg/mL in pH 7.5 buffer
Fibronectin Antibody	BD	610077	Mouse
Fiji	ImageJ		Version 1.53c
Fluorescent Phalloidin	Invitrogen	A12380	568nm
Glass Coverslip	VWR	16004-302	22 × 22 mm
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16220	25% aqueous solution
Hydrochloric Acid	Caledon	6025-1-29	37% aqueous solution
IR Laser	Coherent	Chameleon Vision
Minimal Essential Medium α	Gibco	12561-056
Mounting Medium	Sigma	F4680
Mouse Secondary Antibody	Cell Signaling Technology	4408S	Goat, 488nm
Multi-Photon Microscope	Nikon	A1R MP+
Myosin Light Chain Antibody	Cell Signaling Technology	3672S	Rabbit
NIS Elements	Nikon		Version 5.21.03
Nitric Acid	Caledon	7525-1-29	70% aqueous solution
Photoshop	Adobe		Version 21.2.1
Pluronic F-127	Sigma	P2443	Powder
Poly(vinyl alchohol)	Aldrich	341584	MW 89000-98000, 98% hydrolyzed
Rabbit Secondary Antibody	Cell Signaling Technology	4412S	Goat, 488nm
Shaker	VWR	10127-876	Alsoknown as analog rocker
Sodium Borohydride	Aldrich	452882	Powder
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma	S5136	Powder
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma	S5011	Powder
Spyder	Anaconda	4.1.4
Trypsin	Wisent	325-042-CL	0.05% aqueous solution with 0.53mM EDTA