Kontroll av cellegeometri gjennom infrarød laserassistert mikropatterning

Summary

Protokollen som presenteres her muliggjør automatisert fabrikasjon av mikropatterner som standardiserer celleform for å studere cytoskeletale strukturer i pattedyrceller. Denne brukervennlige teknikken kan settes opp med kommersielt tilgjengelige bildesystemer og krever ikke spesialisert utstyr utilgjengelig for standard cellebiologiske laboratorier.

Abstract

Mikropatterning er en etablert teknikk i cellebiologisamfunnet som brukes til å studere sammenhenger mellom morfologi og funksjon av cellulære rom mens omgå komplikasjoner som oppstår fra naturlige celle-til-celle variasjoner. For å standardisere celleformen er cellene enten begrenset i 3D-former eller kontrollert for limgeometri gjennom klebende øyer. Imidlertid er tradisjonelle mikropatterningsteknikker basert på fotolitografi og dyp UV-etsning sterkt avhengig av rene rom eller spesialisert utstyr. Her presenterer vi en infrarød laserassistert mikropatteringsteknikk (mikrofotopatterning) modifisert fra Doyle et al. som enkelt kan settes opp med kommersielt tilgjengelige bildesystemer. I denne protokollen bruker vi et Nikon A1R MP+ bildebehandlingssystem for å generere mikropatterns med mikronpresisjon gjennom en infrarød (IR) laser som ablates forhåndsinnstilte regioner på poly-vinyl alkoholbelagte deksler. Vi bruker et tilpasset skript for å muliggjøre automatisert mønsterproduksjon med høy effektivitet og nøyaktighet i systemer som ikke er utstyrt med en maskinvare-autofokus. Vi viser at denne IR-laserassisterte mikropatterningsprotokollen (mikrofotopatterning) resulterer i definerte mønstre som celler utelukkende fester seg til og tar på seg ønsket form. Videre kan data fra et stort antall celler beregnes i gjennomsnitt på grunn av standardisering av celleform. Mønstre generert med denne protokollen, kombinert med høyoppløselig bildebehandling og kvantitativ analyse, kan brukes til relativt høye gjennomstrømningsskjermer for å identifisere molekylære spillere som formidler koblingen mellom form og funksjon.

Introduction

Celleform er en nøkkeldeterminant for grunnleggende biologiske prosesser som vevsmorfogenese¹, cellemigrering², celleproliferasjon³og genuttrykk⁴. Endringer i celleformen drives av en intrikat balanse mellom dynamiske omorganiseringer av cytoskjelettet som deformerer plasmamembranen og ekstrinsiske faktorer som eksterne krefter som utøves på cellen og geometrien til cellecelle- og cellematriseadhesjoner⁵. Migrerende mesenchymale celler, for eksempel, polymeriserer et tett aktinnettverk i forkant som skyver plasmamembranen fremover og skaper en bred l....

Protocol

1. Forbehandling av deksler

1. Forbered knirkende rene deksler som beskrevet i Waterman-Storer, 1998²⁵.
2. Forbered 1% (3-aminopropyl)trimethoxysilane (APTMS) løsning og inkuber dekslene i løsningen i 10 min med mild agitasjon. Pass på at dekslene beveger seg fritt i løsningen.
3. Vask dekslene to ganger med dH₂O i 5 min hver.
4. Forbered 0,5% glutaraldehyd (GA) løsning og inkuber dekslene i løsningen i 30 min på en shaker. For 25 deksler, bruk 50 ml g.......

Discussion

Resultatene ovenfor viser at den beskrevne IR-laserassisterte mikropatterningsprotokollen (mikrofotopatterning) gir reproduserbare tilhengermønstre i ulike former som muliggjør manipulering av celleform og cytoskeletal arkitektur. Selv om mange mikropatterningsmetoder har blitt utviklet både før og etter debuten av mikrofotopatterning, har denne metoden flere fordeler. For det første krever det ikke spesialisert utstyr og renrom som vanligvis bare finnes i ingeniøravdelinger. Faktisk, etter hvert som multifotonmikr.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-Aminopropyl)trimethoxysilane	Aldrich	281778
10 cm Cell Culture Dish	VWR	10062-880	Polysterene, TC treated, vented
25X Apo LWD Water Dipping Objective	Nikon	MRD77225
3.5 cm Cell Culture Dish	VWR	10861-586	Polysterene, TC treated, vented
4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)	Thermo	62248	1mg/mL dihydrochloride solution
Bovine Serine Albumin	BioShop	ALB005
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Wisent	311-425-CL
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	E9508
Fibronectin	Sigma-Aldrich	FC010	1mg/mL in pH 7.5 buffer
Fibronectin Antibody	BD	610077	Mouse
Fiji	ImageJ		Version 1.53c
Fluorescent Phalloidin	Invitrogen	A12380	568nm
Glass Coverslip	VWR	16004-302	22 × 22 mm
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16220	25% aqueous solution
Hydrochloric Acid	Caledon	6025-1-29	37% aqueous solution
IR Laser	Coherent	Chameleon Vision
Minimal Essential Medium α	Gibco	12561-056
Mounting Medium	Sigma	F4680
Mouse Secondary Antibody	Cell Signaling Technology	4408S	Goat, 488nm
Multi-Photon Microscope	Nikon	A1R MP+
Myosin Light Chain Antibody	Cell Signaling Technology	3672S	Rabbit
NIS Elements	Nikon		Version 5.21.03
Nitric Acid	Caledon	7525-1-29	70% aqueous solution
Photoshop	Adobe		Version 21.2.1
Pluronic F-127	Sigma	P2443	Powder
Poly(vinyl alchohol)	Aldrich	341584	MW 89000-98000, 98% hydrolyzed
Rabbit Secondary Antibody	Cell Signaling Technology	4412S	Goat, 488nm
Shaker	VWR	10127-876	Alsoknown as analog rocker
Sodium Borohydride	Aldrich	452882	Powder
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma	S5136	Powder
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma	S5011	Powder
Spyder	Anaconda	4.1.4
Trypsin	Wisent	325-042-CL	0.05% aqueous solution with 0.53mM EDTA