Control de la geometría celular a través de micropatterning asistido por láser infrarrojo

Summary

El protocolo presentado aquí permite la fabricación automatizada de micropatrones que estandariza la forma celular para estudiar las estructuras citoesqueléticos dentro de las células de mamíferos. Esta técnica fácil de usar se puede configurar con sistemas de imágenes disponibles en el comercio y no requiere equipos especializados inaccesibles a los laboratorios de biología celular estándar.

Abstract

Micropatterning es una técnica establecida en la comunidad de la biología celular usada para estudiar las conexiones entre la morfología y la función de compartimientos celulares mientras que evita las complicaciones que se presentan de variaciones naturales de la célula-a-célula. Para estandarizar la forma de las células, las células se confinan en moldes 3D o se controlan para la geometría adhesiva a través de islas adhesivas. Sin embargo, las técnicas tradicionales de micropatterning basadas en la fotolitografía y el grabado UV profundo dependen en gran medida de salas limpias o equipos especializados. Aquí presentamos una técnica de micropatterning asistida por láser infrarrojo (microphotopatterning) modificada de Doyle et al. En este protocolo, utilizamos un sistema de imágenes Nikon A1R MP + para generar micropatrones con precisión de micras a través de un láser infrarrojo (IR) que ablaciona regiones preestablecidas en cubiertas recubiertas de alcohol poli-vinílico. Empleamos un script personalizado para permitir la fabricación automatizada de patrones con alta eficiencia y precisión en sistemas no equipados con un enfoque automático de hardware. Mostramos que este ir láser asistido micropatterning (microphotopatterning) protocolos de protocolo da como resultado patrones definidos a los que las células se unen exclusivamente y tomar la forma deseada. Además, los datos de un gran número de celdas se pueden promediar debido a la estandarización de la forma de la celda. Los patrones generados con este protocolo, combinados con imágenes de alta resolución y análisis cuantitativo, se pueden utilizar para pantallas de rendimiento relativamente alto para identificar reproductores moleculares que median el vínculo entre la forma y la función.

Introduction

La forma celular es un determinante clave de procesos biológicos fundamentales como la morfogénesis tisular^1,la migración celular^2,la proliferación celular³y la expresión^{génica 4.} Los cambios en la forma celular son impulsados por un intrincado equilibrio entre los reordenamientos dinámicos del citoesqueleto que deforma la membrana plasmática y factores extrínsecos como las fuerzas externas ejercidas sobre la célula y la geometría de las adherencias célula-célula y célula-matriz^5. La migración de células mesenquimales, por ejemplo, polimeriza una den....

Protocol

1. Preprocesamiento de coverslip

1. Prepare squeaky-clean coverslips como se describe en Waterman-Storer, 1998²⁵.
2. Preparar la solución de trimetoxisilano al 1% (3-aminopropil) (APTMS) e incubar las tapas en la solución durante 10 min con agitación suave. Asegúrese de que los cubrebocas se muevan libremente en la solución.
3. Lave las cubiertas dos veces con dH₂O durante 5 min cada una.
4. Prepare la solución de glutaraldehído (GA) al 0,5% e incube l.......

Discussion

Los resultados anteriores demuestran que el protocolo descrito de micropatterning asistido por láser IR (microphotopatterning) proporciona patrones adherentes reproducibles de varias formas que permite la manipulación de la forma celular y la arquitectura citoesquelético. Aunque se han desarrollado numerosos métodos de micropatterning tanto antes como después del debut del microfotopatterning, este método posee varias ventajas. En primer lugar, no requiere equipos especializados y salas blancas que generalmente sol.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-Aminopropyl)trimethoxysilane	Aldrich	281778
10 cm Cell Culture Dish	VWR	10062-880	Polysterene, TC treated, vented
25X Apo LWD Water Dipping Objective	Nikon	MRD77225
3.5 cm Cell Culture Dish	VWR	10861-586	Polysterene, TC treated, vented
4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)	Thermo	62248	1mg/mL dihydrochloride solution
Bovine Serine Albumin	BioShop	ALB005
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Wisent	311-425-CL
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	E9508
Fibronectin	Sigma-Aldrich	FC010	1mg/mL in pH 7.5 buffer
Fibronectin Antibody	BD	610077	Mouse
Fiji	ImageJ		Version 1.53c
Fluorescent Phalloidin	Invitrogen	A12380	568nm
Glass Coverslip	VWR	16004-302	22 × 22 mm
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16220	25% aqueous solution
Hydrochloric Acid	Caledon	6025-1-29	37% aqueous solution
IR Laser	Coherent	Chameleon Vision
Minimal Essential Medium α	Gibco	12561-056
Mounting Medium	Sigma	F4680
Mouse Secondary Antibody	Cell Signaling Technology	4408S	Goat, 488nm
Multi-Photon Microscope	Nikon	A1R MP+
Myosin Light Chain Antibody	Cell Signaling Technology	3672S	Rabbit
NIS Elements	Nikon		Version 5.21.03
Nitric Acid	Caledon	7525-1-29	70% aqueous solution
Photoshop	Adobe		Version 21.2.1
Pluronic F-127	Sigma	P2443	Powder
Poly(vinyl alchohol)	Aldrich	341584	MW 89000-98000, 98% hydrolyzed
Rabbit Secondary Antibody	Cell Signaling Technology	4412S	Goat, 488nm
Shaker	VWR	10127-876	Alsoknown as analog rocker
Sodium Borohydride	Aldrich	452882	Powder
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma	S5136	Powder
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma	S5011	Powder
Spyder	Anaconda	4.1.4
Trypsin	Wisent	325-042-CL	0.05% aqueous solution with 0.53mM EDTA