सेल चक्र भेदभाव इमेजिंग के साथ युग्मित BrdU-डीएनए लेबलिंग का उपयोग कर वैश्विक डीएनए डबल स्ट्रैंड एंड लकीर का आकलन

डीएनए क्षति प्रतिक्रिया (डीडीआर) का अध्ययन एक जटिल और आवश्यक क्षेत्र है, जो केवल कैंसर के उपचार के लिए डीडीआर-लक्ष्यीकरण दवाओं के उपयोग के कारण अधिक महत्वपूर्ण हो गया है। ये लक्ष्य पॉली (एडीपी-राइबोस) पोलीमरेज़ (पीएआरपी) हैं, जो डीएनए मरम्मत के विभिन्न रूपों को शुरू करते हैं। PARP inhibitors (PARPi) का उपयोग करके इन एंजाइमों को बाधित करना सजातीय पुनर्संयोजन (एचआर) में एक चिकित्सीय भेद्यता प्रदान करके सिंथेटिक घातकता प्राप्त करता है - स्तन कैंसर टाइप 1 (BRCA1), BRCA2, या BRCA2 (PALB2) के साथी और स्थानीयकरण में उत्परिवर्तन के कारण कोशिकाओं की कमी।

PARPi के साथ इलाज की जाने वाली कोशिकाएं डीएनए डबल-स्ट्रैंड ब्रेक (DSBs) जमा करती हैं। इन ब्रेकों को डीएनए एंड लकीर मशीनरी द्वारा संसाधित किया जाता है, जिससे एकल-फंसे हुए (एसएस) डीएनए और बाद में डीएनए मरम्मत का गठन होता है। एक BRCA1-कमी वाले संदर्भ में, डीएनए लकीर अवरोधकों में उत्परिवर्तन के माध्यम से डीएनए लकीर को पुनर्जीवित करना, जैसे कि 53BP1 और DYNLL1, PARPi प्रतिरोध का कारण बनता है। इसलिए, सेल्युलो में डीएनए लकीर की निगरानी करने में सक्षम होने के नाते डीएनए मरम्मत मार्गों की स्पष्ट समझ और PARPi प्रतिरोध को दूर करने के लिए नई रणनीतियों के विकास के लिए महत्वपूर्ण है। Immunofluorescence (IF) -आधारित तकनीकें डीएनए क्षति के बाद वैश्विक डीएनए लकीर की निगरानी के लिए अनुमति देती हैं। इस रणनीति के लिए 5-ब्रोमो-2'-डीऑक्सीयूरिडिन (बीआरडीयू) के साथ लंबी नाड़ी जीनोमिक डीएनए लेबलिंग की आवश्यकता होती है। डीएनए क्षति और डीएनए अंत लकीर के बाद, परिणामी एकल-फंसे हुए डीएनए को विशेष रूप से देशी परिस्थितियों में एंटी-बीआरडीयू एंटीबॉडी द्वारा पता लगाया जाता है। इसके अलावा, कोशिका चक्र के विभिन्न चरणों के बीच अंतर करने के लिए सेल चक्र मार्करों का उपयोग करके डीएनए लकीर का भी अध्ययन किया जा सकता है। एस / जी 2 चरण में कोशिकाएं एचआर के भीतर अंत लकीर के अध्ययन की अनुमति देती हैं, जबकि जी 1 कोशिकाओं का उपयोग गैर-होमोलोगस एंड जॉइनिंग (एनएचईजे) का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। इस IF विधि के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल सेल चक्र भेदभाव के लिए युग्मित इस पेपर में वर्णित है।