蛍光相関分光法を用いたタンパク質凝集の検出

Summary

ここでは、蛍光相関分光法を用いて、細胞ライセートおよび生細胞におけるタンパク質オリゴマーおよび凝集を測定する手順を紹介する。

Abstract

タンパク質凝集は、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、アルツハイマー病(AD)、パーキンソン病(PD)、ハンチントン病(HD)などの神経変性疾患の特徴である。可溶性または拡散性タンパク質オリゴマーまたは凝集体を検出および分析するために、単一分子感度で単一粒子の拡散速度および明るさを検出できる蛍光相関分光法(FCS)が使用されている。しかし、タンパク質凝集検出のための適切な手順とノウハウは広く共有されていません。ここでは、細胞ライセートおよび生細胞における凝集しやすいタンパク質の拡散特性に関するFCS測定の標準的な手順を示す:ALS関連25 kDaカルボキシル末端断片のTAR DNA/RNA結合タンパク質43kDa(TDP25)およびスーパーオキシドジスムターゼ1(SOD1)を示す。代表的な結果は、緑色蛍光タンパク質(GFP)タグ付きTDP25の凝集物の一部が、マウス神経芽細胞腫Neuro2a細胞溶解物の可溶性画分にわずかに含まれていたことを示している。さらに、ALS関連変異を運ぶGFPタグ付きSOD1は、生細胞における拡散が遅い。そこで、FCSを用いた拡散特性を介してタンパク質凝集を検出する手順を紹介します。

Introduction

筋萎縮性側索硬化症(ALS)、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病などの神経変性疾患を含むタンパク質凝^集は毒性 が知られており、細胞や臓器のタンパク質恒常性(プロテオスタシス)を乱し、その後老化につながる可能性がある^。タンパク質凝集のクリアランスは、治療戦略として期待されています;しかし、タンパク質の凝集を防ぎ、タンパク質凝集体(例えば、小分子や薬物)を分解する化学物質はまだ確立されていません。さらに、タンパク質凝集が毒性を発揮する方法は、依然として不可解です。したがって、タンパク質凝集に関する研究プロジェクトを推進するためには、単にタンパク質凝集を検出する高スループット手順を導入することが重要です。タンパク質凝集および凝集特異的蛍光色素の立体構造を認識する抗体を用いたタンパク質凝集検出は広く用いられている^3。しかし、このような古典的な手順を用いた生細胞において特に、凝集を検出することは困難である。

フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)は、タンパク質凝集および構造変化を検出する手順である。しかし、FRETはタンパク質のダイナミクス(例えば、生細胞におけるタンパク質の拡散およびオリゴマー化)を分析することができない^3。そこで、ここでは、単一分子感度

Protocol

1. 材料・試薬

1. 細胞培養用の発熱性フリー溶液および培地を使用する(表1)。
2. 超純水を用いた生化学実験用のソリューションを準備し、DNase/RNaseフリーとして使用します。
3. ロットチェックプロセスで細胞培養に適したFBSを選択します。選択した FBS ロットは定期的に変更されるため、FBS のカタログとロット番号はここでは表すことができません。
4. プラ?.......

Discussion

測定前のシステム校正に関しては、サンプルを測定するために使用されたものと同じガラス製品を使用する必要があります(例えば、8ウェルは、細胞のライセートのためのガラスチャンバーと生細胞用の35mmガラスベースディッシュをカバーする)。ガラス上のRh6Gの吸着のために、その有効濃度が低下することがあります。その場合は、1 μMのような高濃度のRh6G溶液をピンホール調整のためだ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% (w/v) Trypsin-1 mmol/L EDTA·4Na Solution with Phenol Red (Trypsin-EDTA)	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	201-16945
100-mm plastic dishes	CORNING	430167
35-mm glass base dish	IWAKI	3910-035	For live cell measurement
35-mm plastic dishes	Thermo Fisher Scientific	150460
Aluminum plate	Bio-Bik	AB-TC1
C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27	Carl Zeiss		Objective
Cell scraper	Sumitomo Bakelite Co., Ltd.	MS-93100
Cellulose acetate filter membrane (0.22 mm)	Advantech Toyo	25CS020AS
Cover glass chamber 8-wells	IWAKI	5232-008	For solution measurement
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796	basal medium
Fetal bovine serum (FBS)	biosera		Lot check required
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668019
LSM510 META + ConfoCor3	Carl Zeiss		FCS system
Murine neuroblastoma Neuro2a cells	ATCC	CCL-131	Cell line
Opti-MEM I	Thermo Fisher Scientific	31985070
pCAGGS	RIKEN	RDB08938	Plasmid DNA for the transfection carrier
Penicillin-Streptomycin Solution (×100 )	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	168-23191
pmeGFP-C1-TDP25			Plasmid DNA for TDP25 tagged with monomeric eGFP
pmeGFP-N1			Plasmid DNA for eGFP monomer expression
pmeGFP-N1-SOD1-G85R			Plasmid DNA for ALS-linked G85R mutant of SOD1 tagged with monomeric eGFP
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P8304