Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы вводим процедуру измерения олигомеров белка и агрегации в лисате клеток и живых клетках с использованием флуоресцентной корреляционные спектроскопии.

Аннотация

Агрегация белка является отличительной чертой нейродегенеративных расстройств, таких как боковой амиотрофический склероз (ALS), болезнь Альцгеймера (AD), болезнь Паркинсона (PD), болезнь Генттона (HD), и так далее. Для обнаружения и анализа растворимых или диффузных белковых олигомеров или агрегатов была использована флуоресцентная корреляционная спектроскопия (FCS), которая может обнаруживать скорость диффузии и яркость одной частицы с одной чувствительностью молекулы. Тем не менее, надлежащая процедура и ноу-хау для обнаружения агрегации белка не получили широкого широкого общего широкогоства. Здесь мы показываем стандартную процедуру измерения FCS для диффузионных свойств склонных к агрегации белков в лизате клетки и живых клетках: ALS-ассоциированный 25 kDa карбоксил-терминальный фрагмент TAR DNA/RNA-связывающего белка 43 kDa (TDP25) и супероксиддисмутазы 1 (SOD1). Репрезентативные результаты показывают, что часть агрегатов зеленого флуоресцентного белка (GFP) с тегами TDP25 была слегка включена в растворимую долю лизата клеток murine neuroblastoma Neuro2a. Кроме того, GFP-тегами SOD1 проведения ALS связанных мутации показывает более медленное распространение в живых клетках. Соответственно, мы здесь вводим процедуру обнаружения агрегации белка с помощью его диффузионные свойства с помощью FCS.

Введение

Белковые агрегации с участием нейродегенеративных расстройств, таких как боковой амиотрофический склероз (ALS), болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, итак далее 1, как известно, токсичны и будет нарушать белок гомеостаз (протеостаз) в клетках и органах, которые затем могут привести кстарению 2. Очистка агрегации белка ожидается в качестве терапевтической стратегии; однако химические вещества, предотвращая образование агрегации белка и ухудшая белковые агрегаты (например, небольшие молекулы или наркотики), еще не установлены. Более того, как агрегация белка оказывает токсичность остается неуловимым....

протокол

1. Материалы и реагенты

  1. Используйте пирогенные свободные растворы и средние для клеточной культуры(таблица 1).
  2. Подготовка решений для биохимического эксперимента с использованием ультрачистой воды и использовать в качестве DNase / RNase бесплатно.
  3. Выберите подходящий FBS для клеточной культуры с большим количеством процесса проверки. Поскольку выбранный лот FBS регулярно меняется, каталог и номер лота для FBS не могут быть представлены здесь.
  4. Плазмидная ДНК
    1. Подготовка pmeGFP-N15 для выражения мономера eGFP; pmeGFP-C1-TDP256 для выражения GFP-TDP25; pmeGFP-N....

Результаты

Мы провели измерение FCS GFP-TDP25 в лизаторе клеток и SOD1-G85R-GFP в живых клетках. В обоих случаях удалось приобрести положительную амплитуду и гладкие ACF. Мы показали, что часть GFP-TDP25, выраженная в клетках Neuro2a, была восстановлена в растворимой фракции при указанном состоянии6. В раст.......

Обсуждение

Что касается калибровки системы до измерений, то следует использовать те же стеклянные изделия, что и для измерения образца (например, 8-колодцы покрывают стеклянную камеру для ликата клеток и 35-мм стеклянное базовое блюдо для живых клеток). Из-за adorption Rh6G на стекле, его эффективная конце?.......

Раскрытие информации

У этих авторов нет конфликта интересов.

Благодарности

А.К. был поддержан Японского общества содействия науке (JSPS) Грант-в-помощи для научных исследований (C) (#18K06201), грант в помощь от Фонда Накатани по борьбе с новыми коронавирусных инфекций, грант от Университета Хоккайдо Управление по развитию будущих лидеров исследований (L-Station), а также грант в помощь от Hoansha Фонда. М.К. была частично поддержана грантом JSPS по научным исследованиям инновационных областей "Химия для многомолекулярных краудинговых биосистем" (#20H04686) и грантом JSPS по научным исследованиям инновационных областей "Информационная физика живых дел" (#20H05522).

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% (w/v) Trypsin-1 mmol/L EDTA·4Na Solution with Phenol Red (Trypsin-EDTA)Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.201-16945
100-mm plastic dishesCORNING430167
35-mm glass base dishIWAKI3910-035For live cell measurement
35-mm plastic dishesThermo Fisher Scientific150460
Aluminum plateBio-BikAB-TC1
C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27Carl ZeissObjective
Cell scraperSumitomo Bakelite Co., Ltd.MS-93100
Cellulose acetate filter membrane (0.22 mm)Advantech Toyo25CS020AS
Cover glass chamber 8-wellsIWAKI5232-008For solution measurement
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Sigma-AldrichD5796basal medium
Fetal bovine serum (FBS)bioseraLot check required
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668019
LSM510 META + ConfoCor3Carl ZeissFCS system
Murine neuroblastoma Neuro2a cellsATCCCCL-131Cell line
Opti-MEM IThermo Fisher Scientific31985070
pCAGGSRIKENRDB08938Plasmid DNA for the transfection carrier
Penicillin-Streptomycin Solution (×100 )Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.168-23191
pmeGFP-C1-TDP25Plasmid DNA for TDP25 tagged with monomeric eGFP
pmeGFP-N1Plasmid DNA for eGFP monomer expression
pmeGFP-N1-SOD1-G85RPlasmid DNA for ALS-linked G85R mutant of SOD1 tagged with monomeric eGFP
Protease inhibitor cocktailSigma-AldrichP8304

Ссылки

  1. Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. 10, 10-17 (2004).
  2. Hipp, M. S., Kasturi, P., Hartl, F. U. The proteostasis network and its decline in ageing. Nature Revie....

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

170

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены