Assemblage de modèles de bicouches lipidiques supportées et suspendues imitant des cellules pour l’étude des interactions moléculaires

Résumé

Ce protocole décrit la formation de cellules imitant les vésicules unilipidiques et multilipidiques, les bicouches lipidiques soutenues et les bicouches lipidiques en suspension. Ces modèles in vitro peuvent être adaptés pour incorporer une variété de types de lipides et peuvent être utilisés pour étudier diverses interactions entre molécules et macromolécules.

Résumé

Les membranes cellulaires modèles sont un outil de dépistage utile avec des applications allant de la découverte précoce de médicaments aux études de toxicité. La membrane cellulaire est une barrière protectrice cruciale pour tous les types de cellules, séparant les composants cellulaires internes de l’environnement extracellulaire. Ces membranes sont composées en grande partie d’une bicouche lipidique, qui contient des groupes de tête hydrophile externe et des groupes de queue hydrophobes internes, ainsi que diverses protéines et cholestérol. La composition et la structure des lipides eux-mêmes jouent un rôle crucial dans la régulation de la fonction biologique, y compris les interactions entre les cellules et le microenvironnement cellulaire, qui peut contenir des produits pharmaceutiques, des toxines biologiques et des toxiques environnementaux. Dans cette étude, des méthodes pour formuler des bicouches unilipidiques et multilipidiques soutenues et en suspension imitant les cellules lipidiques sont décrites. Auparavant, des bicouches lipidiques unilipidiques phosphatidylcholine (PC) ainsi que des bicouches lipidiques multilipidiques inspirées du trophoblaste placentaire ont été développées pour être utilisées dans la compréhension des interactions moléculaires. Ici, les méthodes pour réaliser les deux types de modèles bicouches seront présentées. Pour les cellules imitant les bicouches multilipidiques, la composition lipidique souhaitée est d’abord déterminée par extraction lipidique à partir de cellules primaires ou de lignées cellulaires, suivie d’une chromatographie liquide-spectrométrie de masse (LC-MS). En utilisant cette composition, les vésicules lipidiques sont fabriquées à l’aide d’une méthode d’hydratation et d’extrusion en couche mince et leur diamètre hydrodynamique et leur potentiel zêta sont caractérisés. Les bicouches lipidiques supportées et en suspension peuvent ensuite être formées à l’aide d’une microbalance à cristaux de quartz avec surveillance de la dissipation (QCM-D) et sur une membrane poreuse pour une utilisation dans un test de perméabilité à membrane artificielle parallèle (PAMPA), respectivement. Les résultats représentatifs mettent en évidence la reproductibilité et la polyvalence des modèles de bicouches lipidiques de membrane cellulaire in vitro. Les méthodes présentées peuvent aider à évaluer rapidement et facilement les mécanismes d’interaction, tels que la perméation, l’adsorption et l’incorporation, de diverses molécules et macromolécules avec une membrane cellulaire, aidant ainsi au dépistage des candidats médicaments et à la prédiction de la toxicité cellulaire potentielle.

Introduction

La membrane cellulaire, composée principalement de phospholipides, de cholestérol et de protéines, est un composant crucial de toutes les cellules vivantes¹. Avec une organisation guidée par l’amphiphilie lipidique, la membrane cellulaire fonctionne comme une barrière protectrice et régule la façon dont la cellule interagit avec son environnement^{environnant 2}. Plusieurs processus cellulaires dépendent de la composition lipidique et protéique de la membrane^1,2. Par exemple, les interactions de la membrane cellulaire sont importantes pour une administration efficac....

Protocole

1. Développer des vésicules unilipidiques

1. Méthode d’hydratation en couche mince
   1. Préparation et stockage de solutions mères lipidiques
      REMARQUE: Toutes les étapes d’utilisation du chloroforme doivent être effectuées dans une hotte chimique. Le chloroforme doit toujours être pipeté à l’aide d’embouts de pipette en fibre de carbone sans danger pour les solvants. Les solutions contenant du chloroforme doivent toujours être stockées dans des flacons en verre.
      1. Préparer une solution mère lipidique de 10 mg/mL en ajoutant le volume approprié de chloroforme dans le flacon contenant la poudre lipidique et bien mélanger. Par exemple, ajouter 20 mL de....

Résultats

Ce protocole détaille les méthodes de formation des bicouches lipidiques supportées et suspendues (Figure 1). La première étape pour former une bicouche lipidique soutenue consiste à développer des vésicules lipidiques. La mini-extrudeuse permet de préparer de petits volumes de vésicules lipidiques (1 mL ou moins), tandis que la grande extrudeuse permet de préparer 5 à 50 mL de vésicules lipidiques en un seul lot. Les distributions granulométriques des vésicules unilipidiques .......

Discussion

Ce protocole permet la formation de vésicules lipidiques, de bicouches lipidiques soutenues et de bicouches lipidiques en suspension. Ici, des étapes critiques sont présentées pour former chacune de ces structures. Lors de la formation de vésicules lipidiques, il est important d’extruder au-dessus de la température de transition du lipide³⁹. Lorsqu’il est en dessous de la température de transition, le lipide est physiquement présent dans sa phase de gel ordonnée³⁹

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine  (POPC, 16:0-18:1 PC)	Avanti Polar Lipids	850457
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) (POPS, 16:0-18:1 PS)	Avanti Polar Lipids	840034
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (16:0-18:1 PE)	Avanti Polar Lipids	850757
1,2-dioleoyl-sn-glycero-2-phospho-L-serine (DOPS, 18:1 PS)	Avanti Polar Lipids	840035
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC, 18:1 (Δ9-Cis) PC)	Avanti Polar Lipids	850375
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE, 18:1 (Δ9-Cis) PE)	Avanti Polar Lipids	850725
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (chloride salt) (18:0 EPC (Cl Salt))	Avanti Polar Lipids	890703
3 mL Luer-Loc syringes	BD	309657
40 mL sample vial, amber with polytetrafluoroethylene (PTFE)/rubber liner	Duran Wheaton Kimble	W224605
Acetonitrile	Sigma-Aldrich	271004
Alconox	Fisher Scientific	50-821-781
Ammonium formate	Millipore Sigma	LSAC70221
C18, 3.5 um x 50 mm column, SunFire	Waters	186002551
Chloroform	Millipore Sigma	LSAC288306
Cuvette UV Micro LCH 8.5 mm, 50 um, RPK	Sarstedt	67.758.001
Di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP)	Millipore Sigma	36735
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Millipore Sigma	LSAC472301
Ethanol	Pharmco	111000200
Filter supports, 10 mm	Avanti Polar Lipids	610014	Size for mini extruder
Folded capillary zeta cell	Malvern Panalytical	DTS1070
Isopropanol	Sigma-Aldrich	190764-4L
Kimwipes	Kimberly Clark	34256
L-α-phosphatidylinositol (soy) (Soy PI)	Avanti Polar Lipids	840044
L-α-phosphitidylcholine (Egg, Chicken)	Avanti Polar Lipids	840051
LiposoFast ® LF-50	Avestin, Inc.
Methanol	Sigma-Aldrich	179337 - 4L
Mini-extruder set with holder/heating block	Avanti Polar Lipids	610000
MultiScreen-IP Filter Plate, 0.45 µm, clear, sterile	Millipore Sigma	MAIPS4510	for PAMPA studies
Nitrogen gas, ultrapure	TechAir	NI T5.0
Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 19 mm, 0.1 um	Whatman	800309	Size for mini extruder
Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 25 mm, 0.1 um	Whatman	110605	Size for large extruder
Parafilm	Bemis	PM999
Phosphate buffer saline (PBS), 10x	Genesee Scienfitic	25-507X	Dilute to 1x
Qsoft 401 software	Biolin Scientific
Quartz Crystal Microbalance with Dissipation Q-Sense Analyzer	Biolin Scientific
Scintillation vials, borosilicate glass vials, 20 mL	Duran Wheaton Kimble	986561
Silicon Dioxide, thin QSensors	Biolin Scientific	QSX 303
Sodium chloride (NaCl)	Millipore Sigma	LSACS5886
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Fisher Scientific	BP166-100
Solvent Safe pipette tips	Sigma-Aldrich	S8064
Sphingomyelin (Egg, Chicken)	Avanti Polar Lipids	860061
Trizma base	Millipore Sigma	LSACT1503
Trypsin-ethylenediaminetretaacetic acid	Caisson Labs	TRL01-6X100ML
Whatman drain disc, 25 mm	Whatman	230600	Size for large extruder
Zetasizer ZS90	Malvern Panalytical
Zetasizer 7.01 software	Malvern Panalytical