המחקר נתמך כספית על ידי הקרן הלאומית למחקר (NRF) והמועצה למחקר רפואי בדרום אפריקה (SAMRC). ברצוננו להודות לשירות מעבדות הבריאות הלאומי (NHLS) על רכישת מנתח תאי גויאבה מוזה. כל הנתונים בפרסום זה נוצרו עם Biorender.com.

הערה: פרוטוקול זה מתאר שלבים בהכנת התא, ספירת תאים, צביעת תאים וניתוח של תאי SiHa שטופלו ב-D באמצעות בדיקות מסחריות ציטומטריות של זרימה שנמדדו ונותחו על ציטומטר זרימה (איור 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62663/62663fig2v2.jpg"> איור 2: זרימת עבודה לזיהוי סמנים ביולוגיים אפופטוטיים ביוכימיים על-ידי ציטומטריית זרימה. תאים עוברים תרבית ומטופלים כמתואר בפרוטוקול שלב 1.1. (1) תאים מתורבתים, (2) ממוספרים ו-(3) מוכתמים בריאגנטים פלואורסצנטיים, ו-(4) מנותחים על-ידי ציטומטר זרימה מבנצ'טופ. הנתונים מגודרים עוד יותר, ומנותחים סטטיסטית. קיצורים: 7-AAD = 7-aminoactinomycin D; PBS = מלח חוצץ פוספט; PE = Phycoerythrin; TMRE = tetramethylrhodamine אתיל אסטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62663/62663fig2v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
1. הכנת תרבית תאים וטיפולים לציטומטריית זרימה
הערה: יש לוודא שמתבצע שימוש בטכניקה אספטית בעת הטיפול בתרביות תאים.
<ol><li>לגדל תרביות תאים בסביבת CO 2 לחה ב 37 ° C עם 5% CO2. ודא כי תרבית תאים היא כ 70% ב בקבוק האב לפני העברת תאים לניסויים.</li>
	<li>הסר את המדיום מן הצלוחית, לשטוף תאים עם 1x פוספט-buffered מלוחים (PBS) ולהוסיף 500 μL של טריפסין כדי לנתק את התאים. לאחר שהתאים מתחילים להתעגל ולהתנתק מהצלוחית, דופקים בחדות את בסיס הבקבוק על הספסל כדי לנתק את התאים. לאחר מכן נטרלו את הטריפסין על ידי הוספת כ -5 מ"ל של מדיום תרבית טרי בתוספת 10% נסיוב עגל עוברי לפני ספירת התאים.</li>
	<li>תאי זרע ב 15,000 תאים / מ"ל ב 3 מ"ל של תווך תרבית תאים בצלחת תרבית תאים 6 בארות. לדגור על צלחות התרבית במשך הלילה ב 37 ° C עם 5% CO2 כדי לאפשר את החיבור של התאים לתחתית הבאר.</li>
	<li>טפל בתרביות הניסוי עם 100 ng/mL actinomycin D ובבקרות המדיום והממס עם מדיום תרבית טרי ודימתיל סולפוקסיד (DMSO), בהתאמה, במשך 24 שעות. לאסוף את המדיום בילה בצינור 15 מ"ל ולשטוף תאים עם 1x PBS. לאחר מכן, להוסיף את 1x PBS לשטוף את הצינור, ולאחר מכן להוסיף 500 μL של טריפסין לבאר. לאחר מכן, נטרלו את הטריפסין על ידי הוספת 5 מ"ל של מדיום תרבית טרי. הערה: (1) דגירה ממושכת של טריפסין או נטרול לא מלא עלולים לעכל את התאים ולפגוע בקרום התא שלהם, מה שעלול להטות את התוצאות. בנוסף, הוא עשוי גם לשנות את הא-סימטריה של קרום התא, ובכך את הנגישות לפוספטידיל-סרין. (2) תאים שהתנתקו וצפים אל פני השטח יכולים להיכלל בניתוח הבא על ידי צנטריפוגה של התווך שהוסר במהירות של 300 × גרם למשך 5 דקות והשעיה מחדש של התאים בתווך תרבית טרי.</li>
</ol>2. ספירת תאים באמצעות בדיקת הכדאיות
<ol><li>פיפטה 450 μL של יודיד פרופידיום בצינור מיקרוצנטריפוגה. הוסף 50 μL של תרחיף התא לצינור microcentrifuge. דוגרים על הצינור בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. מנה את התאים לפי ציטומטריית זרימה (עיין בסעיף 4).</li>
	<li>לדלל את כל הדגימות לריכוז של 1 × 106 תאים / מ"ל עם מדיום תרבית תאים לפני שתמשיך לבדיקות אפופטוזיס.</li>
</ol>3. צביעת תאים לציטומטריית זרימה
הערה: תנאים סטריליים אינם נדרשים עבור חלק זה של הפרוטוקול.
<ol><li>איתור החצנת פוספטידיל-סרין באמצעות Annexin V<ol><li>הוסף 100 μL של תרחיף התא לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה. הוסף 100 μL של תערובת 1:1 של Annexin V מצומד פלואורסצנטי ומגיב 7-AAD. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות, מוגן מאור.</li>
	</ol></li>
	<li>ניתוח של דפולריזציה של קרום מיטוכונדריאלי<ol><li>צנטריפוגה 100 μL של תרחיף התא ב 300 × גרם במשך 5 דקות ולהשליך את supernatant.</li>
		<li>יש להשהות מחדש את התאים ב-1 מ"ל של 1x PBS, להוסיף 100 μL של תמיסת צביעת TMRE לכל דגימה, ולערבב את המתלה על ידי פיפטינג גב עדין.</li>
		<li>לדגור על התאים במשך 20 דקות בסביבה CO2 לח ב 37 ° C. עטפו את הדגימות ברדיד אלומיניום נקי כדי להגן מפני אור. הערה: פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית הוא סמן פונקציונלי הרגיש לשינויים קלים בסביבת התא. לכן, יש לדגור ולמדוד דגימות בתנאים זהים (טמפרטורה, pH והזמן שחלף בין תחילת הדגירה למדידה פלואורסצנטית) כדי לשמור על יכולת השחזור). כמו כן, שימו לב שהגנה לא מספקת על דגימות מאור גורמת לפוטו-הלבנה של פלואורופורים וכתוצאה מכך פלואורסצנטיות נפלטת נמוכה באופן שגוי.</li>
		<li>לאחר הדגירה, יש להוסיף 5 μL של תמיסת צביעה 7-AAD לכל דגימה ולערבב. יש לדגור במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור.</li>
	</ol></li>
	<li>איתור קספאז-3 ו-7- מסוף מופעל באמצעות מצע קספז DEVD הערה: הפתרונות הבאים מוכנים לפני ביצוע בדיקה זו.<ol><li>דלל את הפפטיד קושר ה- DNA הקשור ל- DEVD ב- DMSO ליחס של 1:8 עם PBS סטרילי 1x כדי להפוך את פתרון העבודה לזיהוי קספאז. אחסנו את התמיסה על קרח או בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס, מוגנת מפני אור. הערה: כל דגימה תדרוש 5 μL של פתרון זה.</li>
		<li>הוסף 2 μL של תמיסת מלאי 7-AAD ל- 148 μL של 1x PBS כדי ליצור את פתרון העבודה 7-AAD. אחסנו את התמיסה על קרח או בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס, מוגנת מפני אור. הערה: כל דגימה תדרוש 150 μL של פתרון זה.</li>
		<li>צנטריפוגה 50 μL של תרחיף התא במשך 5 דקות ב 300 × גרם. השליכו את הסופרנטנט. להשהות מחדש את התאים ב 50 μL של 1x PBS, ואחריו 5 μL של פתרון עבודה גילוי קספאז. מערבבים היטב.</li>
		<li>שחררו את מכסה הצינורות ודגרו במשך 30 דקות בסביבת CO2 לחה בטמפרטורה של 37°C, מוגנת מפני אור. הוסף 150 μL של פתרון העבודה 7-AAD לכל דגימה וערבב. יש לדגור במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור.</li>
	</ol></li>
	<li>איתור שברי DNA דו-גדיליים ונזק כולל לדנ"א<ol><li>צנטריפוגה 50 μL של תרחיף התא במשך 5 דקות ב 300 × גרם. השליכו את הסופרנטנט.</li>
		<li>להשעות מחדש את התאים ב 500 μL של 1x PBS. מוסיפים 500 μL של חיץ קיבוע מבוסס פורמלדהיד ומערבבים. לדגור את הדגימות על קרח במשך 10 דקות.</li>
		<li>צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 300 × גרם ולהשליך את supernatant. להשהות מחדש את התאים ב 90 μL של 1x PBS בצינור מיקרוצנטריפוגה. הוסף 10 μL של תמיסת הנוגדנים לצינור המיקרוצנטריפוגה. יש לדגור בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות בחושך.</li>
		<li>הוסף 100 μL של 1x PBS וצנטריפוגה למשך 5 דקות ב 300 × גרם. השליכו את הסופרנטנט. להשעות מחדש את התאים ב 200 μL של 1x PBS.</li>
	</ol></li>
</ol>4. הריצו דגימות על ציטומטר הזרימה.
<ol><li>אמת את הביצועים האנליטיים של ציטומטר הזרימה על-ידי הפעלת ערכת בדיקת המערכת של המכשיר. אל תמשיך עם הפעלת דוגמאות עד שכל הבדיקות יושלמו ויעבורו.</li>
	<li>אתר את הבדיקה הרצויה על-ידי עיון בקטלוג של בדיקות מתוכנתות מראש במכשיר ובחר הפעל בדיקה.<ol><li>ערבבו את הדגימה על ידי פיפטציה עדינה לאחור לפני העמסת הדגימה על ציטומטר הזרימה. הערה: ערבוב הולם מבטיח שהתאים יישארו בהשעיה ומונע ספירת תאים נמוכה.</li>
		<li>ראשית, טען דגימת בקרה שלילית על ציטומטר הזרימה, ובחר הפעל (כוונן הגדרות) כך שהמכשיר יתחיל לשאוף את הדגימה ויספק תצוגה מקדימה בזמן אמת של אירועים שזוהו. עיין בטבלת החומרים לקבלת שם הכלי ופרטים.</li>
		<li>באמצעות התצוגה המקדימה החיה, התאם את ערכי הסף עבור פלואורסצנטיות וגודל התא וצייר שער מלבני סביב אוכלוסיית התא. גררו את סמן הסף כדי לא לכלול פסולת סלולרית. בחר הבא (הגדר פרופיל בריאות) כדי להמשיך. הערה: חשוב לדעת את גודל התאים. גרור את המחוונים וצפה בשינויים באופן התוויית האירועים שזוהו בתצוגה המקדימה בזמן אמת, מכיוון שהדבר יודיע על בחירה מדויקת של ערכי הסף. אם פסולת תאית אינה נשללת בשלב זה, לא ניתן להסיר אותה בניתוחים שלאחר הרכישה.</li>
		<li>הקש וגרור את סמני הרביע כדי להפריד בין אוכלוסיות התאים וכדי שהמכשיר יתווה אירועים בזמן אמת. השתמש בתרשימים אלה כדי להנחות את משתמש הקצה לגבי המיקום המתאים של סמני הרביע. בחר הבא (אמת דוגמאות) כדי להמשיך כך שהמכשיר יציג סיכום של ההגדרות. לאחר סקירת ההגדרות, בחר הבא (אמת הגדרות) כדי להחיל הגדרות אלה על כל הדגימות בניסוי. הערה: המכשיר מספק תצוגה מקדימה חיה של 2 דקות של תאים המשמשים לכוונון הגדרות המכשיר. אם פג תוקפה של מגבלת זמן זו, המכשיר ישחרר את הדגימה, ויהיה צורך לחזור על שלבים 4.2.2-4.2.4. מוציאים את הדגימה ומערבבים היטב לפני טעינה מחדש והמשך.</li>
		<li>שער אוכלוסיית תאים על-ידי ציור אזור סביב אוכלוסיית התא. התאם ערכי סף עבור פלואורסצנטיות וגודל תא באמצעות המחוונים הממוקמים על ציר x ו- y של התצוגה המקדימה החיה. החילו הגדרות אלה על כל הדגימות בניסוי.</li>
		<li>ערבבו את הדגימה הראשונה על ידי פיפטציה עדינה לאחור וטענו את הדגימה הראשונה על ציטומטר הזרימה ובחרו באפשרות הבא. תן שם לדוגמה ובחר הפעל כך שהמערכת תתחיל להפעיל את הדגימה. הערה: המכשיר יכול להריץ דגימה אחת בלבד בכל פעם.</li>
		<li>לאחר שכל הדגימות הופעלו, שמור את הניסוי על ידי מתן כותרת מתאימה. שמור את הגדרות הניסוי הנוכחי לאחזור בריצות עתידיות (אופציונלי).</li>
	</ol></li>
</ol>5. ניתוח לאחר רכישה
<ol><li>במידת הצורך, בצע כוונון עדין של שערים או סמני רביע לאחר הרכישה.</li>
	<li>אתר את הניסוי הדורש התאמה על-ידי ניווט בדפדפן הקבצים של המערכת ופתח את הניסוי.</li>
	<li>הקש על התצוגה המקדימה של התמונה הממוזערת של העלילה כדי להגדיל אותה. הקש על הפינה השמאלית העליונה או השמאלית התחתונה של שער התא כדי להתאים את מידות השער. כדי לכוונן את הסמנים המרובעים, הקש על הצטלבות הקו האנכי והאופקי כדי להזיז את הסמנים כפי שהם. כדי לכוונן את הזווית של כל קו, הקש על הקו וגרור את נקודת האחיזה.</li>
	<li>התאם את הסמנים (כפי שתואר קודם לכן בשלבים 4.1.3-4.1.4) כרצונך והחל הגדרות אלה על כל הדגימות בניסוי על-ידי בחירת סמל סימן הביקורת , סימון כל הדגימות ובחירה באפשרות קבל.</li>
</ol>6. ניתוח סטטיסטי
<ol><li>הפעל בדיקות בטריפליקט והפעל ניתוח שונות (ANOVA) עם בדיקת בונפרוני פוסט-הוק כדי להעריך הבדלים משמעותיים בין הדגימות והבקרות שטופלו. הערה: המבחן הסטטיסטי הנבחר תלוי בחוקר ובמשתנים המנותחים.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+cell+death:+Recommendations+of+the+Nomenclature+Committee+on+Cell+Death+2018.">Molecular mechanisms of cell death: Recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2018.</a> Cell Death and Differentiation. 25 (3), 486-541 (2018).</li><li>Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis:+a+basic+biological+phenomenon+with+wide-ranging+implications+in+tissue+kinetics.">Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics.</a> British journal of cancer. 26 (4), 239-257 (1972).</li><li>Riccardi, C., Nicoletti, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+apoptosis+by+propidium+iodide+staining+and+flow+cytometry.">Analysis of apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1458-1461 (2006).</li><li>Edinger, A. L., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Death+by+design:+apoptosis,+necrosis+and+autophagy.">Death by design: apoptosis, necrosis and autophagy.</a> Current Opinion in Cell Biology. 16 (6), 663-669 (2004).</li><li>Arends, M. J., Morris, R. G., Wyllie, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis.+The+role+of+the+endonuclease.">Apoptosis. The role of the endonuclease.</a> The American journal of pathology. 136 (3), 593-608 (1990).</li><li>Majno, G., Joris, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis,+oncosis,+and+necrosis.+An+overview+of+cell+death.">Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death.</a> Am J Pathol. 146 (1), 3-15 (1995).</li><li>Darzynkiewicz, Z., Traganos, F., Al-Rubeai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Apoptosis. , 33-73 (1998).</li><li>Wlodkowic, D., Skommer, J., Darzynkiewicz, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry-based+apoptosis+detection.">Flow cytometry-based apoptosis detection.</a> Methods in molecular biology. 559, 19-32 (2009).</li><li>. Introduction to Flow Cytometry Basics Available from: <a target="_blank" href="https://www.bio-rad-antibodies.com/introduction-to-flow-cytometry.html">https://www.bio-rad-antibodies.com/introduction-to-flow-cytometry.html</a> (2021)</li><li>Telford, W. G., Komoriya, A., Packard, B. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+localized+caspase+activity+in+early+apoptotic+cells+by+laser+scanning+cytometry.">Detection of localized caspase activity in early apoptotic cells by laser scanning cytometry.</a> Cytometry. 47 (2), 81-88 (2002).</li><li>Castedo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+mitochondrial+alterations+associated+with+apoptosis.">Quantitation of mitochondrial alterations associated with apoptosis.</a> J Immunol Methods. 265 (1-2), 39-47 (2002).</li><li>McKinnon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry:+An+Overview.">Flow Cytometry: An Overview.</a> Current protocols in immunology. 120, 1-11 (2018).</li><li>Macey, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+principles+and+clinical+applications.">Flow cytometry: principles and clinical applications.</a> Med Lab Sci. 45 (2), 165-173 (1988).</li><li>Darzynkiewicz, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+of+apoptotic+cells+measured+by+flow+cytometry.">Features of apoptotic cells measured by flow cytometry.</a> Cytometry. 13 (8), 795-808 (1992).</li><li>Darzynkiewicz, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytometry+in+cell+necrobiology:+Analysis+of+apoptosis+and+accidental+cell+death+(necrosis).">Cytometry in cell necrobiology: Analysis of apoptosis and accidental cell death (necrosis).</a> Cytometry. 27 (1), 1-20 (1997).</li><li>Ormerod, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+study+of+apoptotic+cells+by+flow+cytometry.">The study of apoptotic cells by flow cytometry.</a> Leukemia. 12 (7), 1013-1025 (1998).</li><li>van Engeland, M., Nieland, L. J., Ramaekers, F. C., Schutte, B., Reutelingsperger, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annexin+V-affinity+assay:+a+review+on+an+apoptosis+detection+system+based+on+phosphatidylserine+exposure.">Annexin V-affinity assay: a review on an apoptosis detection system based on phosphatidylserine exposure.</a> Cytometry. 31 (1), 1-9 (1998).</li><li>Vermes, I., Haanen, C., Reutelingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+of+apoptotic+cell+death.">Flow cytometry of apoptotic cell death.</a> Journal of Immunological Methods. 243 (1), 167-190 (2000).</li><li>Jahan-Tigh, R. R., Ryan, C., Obermoser, G., Schwarzenberger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry.">Flow cytometry.</a> J Invest Dermatol. 132 (10), 1-6 (2012).</li><li>L&#246;vborg, H., Gullbo, J., Larsson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+apoptosis-classical+and+emerging+techniques.">Screening for apoptosis-classical and emerging techniques.</a> Anti-cancer drugs. 16 (6), 593-599 (2005).</li><li>Vorobjev, I. A., Barteneva, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-parametric+imaging+of+cell+heterogeneity+in+apoptosis+analysis.">Multi-parametric imaging of cell heterogeneity in apoptosis analysis.</a> Methods. 112, 105-123 (2017).</li><li>Telford, W. G., Komoriya, A., Packard, B. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+analysis+of+apoptosis+by+flow+and+image+cytometry.">Multiparametric analysis of apoptosis by flow and image cytometry.</a> Methods in molecular biology. 263, 141-160 (2004).</li><li>Kagami, S., Rizzo, H. L., Lee, J. J., Koguchi, Y., Blauvelt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+Th17,+Th22,+and+Th1+cells+are+increased+in+psoriasis.">Circulating Th17, Th22, and Th1 cells are increased in psoriasis.</a> J Invest Dermatol. 130 (5), 1373-1383 (2010).</li><li>. Muse&#174; Annexin V &amp; Dead Cell Kit Available from: <a target="_blank" href="https://www.luminexcorp.com/muse-annexin-v-dead-cell-kit/">https://www.luminexcorp.com/muse-annexin-v-dead-cell-kit/</a> (2019)</li><li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+compensation+for+flow+cytometry:+visualization+artifacts,+limitations,+and+caveats.">Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats.</a> Cytometry. 45 (3), 194-205 (2001).</li><li>Kroemer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classification+of+cell+death:+recommendations+of+the+Nomenclature+Committee+on+Cell+Death.">Classification of cell death: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death.</a> Cell Death and Differentiation. 12 (2), 1463-1467 (2005).</li><li>Apoptosis assays and markers guide. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/kits/apoptosis-assays">https://www.abcam.com/kits/apoptosis-assays</a> (2021)</li><li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+for+apoptosis.+Flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labelled+Annexin+V.">A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V.</a> Journal of Immunological Methods. 184 (1), 39-51 (1995).</li><li>Elmore, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis:+A+Review+of+Programmed+Cell+Death.">Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death.</a> Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).</li><li>Saelens, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxic+proteins+released+from+mitochondria+in+cell+death.">Toxic proteins released from mitochondria in cell death.</a> Oncogene. 23 (16), 2861-2874 (2004).</li><li>Muse&#8482; MitoPotential Kit User's Guide. Luminex Corporation Available from: <a target="_blank" href="https://www.luminexcorp.com/muse-mitopotential-kit">https://www.luminexcorp.com/muse-mitopotential-kit</a> (2013)</li><li>McIlwain, D. R., Berger, T., Mak, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+functions+in+cell+death+and+disease.">Caspase functions in cell death and disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (4), 008656 (2013).</li><li>Wigdal, S. S., Kirkland, R. A., Franklin, J. L., Haak-Frendscho, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+c+release+precedes+mitochondrial+membrane+potential+loss+in+cerebellar+granule+neuron+apoptosis:+lack+of+mitochondrial+swelling.">Cytochrome c release precedes mitochondrial membrane potential loss in cerebellar granule neuron apoptosis: lack of mitochondrial swelling.</a> Journal of Neurochemistry. 82 (5), 1029-1038 (2002).</li><li>Muse&#174; Caspase-3/7 Kit. Luminex Corporation Available from: <a target="_blank" href="https://www.luminexcorp.com/muse-caspase-3-7-kit/#overview">https://www.luminexcorp.com/muse-caspase-3-7-kit/#overview</a> (2019)</li><li>H&#228;cker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphology+of+apoptosis.">The morphology of apoptosis.</a> Cell and Tissue Research. 301 (1), 5-17 (2000).</li><li>Muse&#174; Multi-Color DNA Damage Kit User's Guide. Luminex Corporation Available from: <a target="_blank" href="https://www.luminexcorp.com/muse-multi-color-dna-damage-kit/#overview">https://www.luminexcorp.com/muse-multi-color-dna-damage-kit/#overview</a> (2020)</li><li>Kleeff, J., Kornmann, M., Sawhney, H., Korc, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actinomycin+D+induces+apoptosis+and+inhibits+growth+of+pancreatic+cancer+cells.">Actinomycin D induces apoptosis and inhibits growth of pancreatic cancer cells.</a> International journal of cancer. 86 (3), 399-407 (2000).</li><li>Wlodkowic, D., Skommer, J., Darzynkiewicz, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytometry+of+apoptosis.+Historical+perspective+and+new+advances.">Cytometry of apoptosis. Historical perspective and new advances.</a> Experimental oncology. 34 (3), 255-262 (2012).</li><li>Szeberenyi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+actinomycin+D+on+RNA+metabolism+in+human+cells.">The effect of actinomycin D on RNA metabolism in human cells.</a> Biochem Mol Biol Educ. 34 (1), 50-51 (2006).</li><li>Ginell, S., Lessinger, L., Berman, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+and+molecular+structure+of+the+anticancer+drug+actinomycin+D--some+explanations+for+its+unusual+properties.">The crystal and molecular structure of the anticancer drug actinomycin D--some explanations for its unusual properties.</a> Biopolymers. 27 (5), 843-864 (1988).</li><li>Hou, M. H., Robinson, H., Gao, Y. G., Wang, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+actinomycin+D+bound+to+the+CTG+triplet+repeat+sequences+linked+to+neurological+diseases.">Crystal structure of actinomycin D bound to the CTG triplet repeat sequences linked to neurological diseases.</a> Nucleic Acids Res. 30 (22), 4910-4917 (2002).</li></ol>

Luminex® Corporation סיפקה באדיבות דמי עיבוד מאמרים.

במחקר זה, תאי SiHa שטופלו באקטינומיצין D שנותחו על ידי FC חשפו סמנים ביולוגיים מוקדמים ומאוחרים משמעותיים לאפופטוזיס. תנאים תת-אופטימליים להכנת התא, ספירה וצביעה זיהו תוצאות לא מדויקות, והדגישו את הצורך בהקפדה על הוראות היצרן בעת ביצוע FC.
מחקר זה של אפופטוזיס על ידי זיהוי מוקדם ומאוחר של סמנים ביולוגיים תואם את הנחיות NCCD1 לחקר אפופטוזיס. תרביות SiHa שטופלו ב-Actinomycin D הדגימו סמנים ביולוגיים חיוביים לשלבים אפופטוטיים מוקדמים ומאוחרים. בדיקת Annexin V/PI ובדיקת החדירות המיטוכונדריאלית הראו כי אקטינומיצין D גרם לדפוס PS-flip ולפיזור המעבר של הממברנה המיטוכונדריאלית, בהתאמה. ברגע שתאים אפופטוטיים מגיעים לנקודת האל-חזור הנגרמת על ידי הפרעה מיטוכונדריאלית, הקספזות הסופיות מופעלות 3,7. ההפעלה של caspases מסוף 3 ו 7 שנצפו במחקר זה מצביע על אפופטוזיס בשלב מאוחר. יתר על כן, הפעלת קספז טרמינלי גורמת לפיצול DNA אינטרנוקלאוזומלי ולפיצול DNA נרחב, אשר באופן קלאסי דווח כדפוס סולם מדרגות שנצפה על ידי אלקטרופורזה ג'ל28,38.
הנזק הגרעיני עם כספומט ו- H2A. בדיקת נזק לדנ"א של X FC הראתה שברים דו-גדיליים בדנ"א ונזק כולל לדנ"א. תוצאות אלה אישרו נזק גרעיני אפופטוטי קלאסי במורד הזרם (karyorrhexis ו karyorrlysis) בתרבויות ניסיוניות. השימוש בסמנים ביולוגיים ציטומטריים מרובים של זרימה זיהה אפוא את האירועים הרב-שלביים הרציפים באפופטוזיס וזיהה באופן מדויק ומשכפל אוכלוסיות תאים בשלבים אפופטוטיים מוקדמים ומאוחרים. ממצאים אלה עולים בקנה אחד עם התכונות הפרו-אפופטוטיות הידועות של אקטינומיצין D בטיפול בסרטן בבני אדם 37,39,40,41 ותומכים עוד יותר בשימוש באקטינומיצין D כבקרה חיובית בניסויי תרבית תאי FC החוקרים אפופטוזיס.
התגברות אוכלוסיות התאים במחקר זה התבססה על בקרות תווך וממס שליליות, שהפרידו בין תאים אפופטוטיים לתאים בריאים. לחלופין, תערובת של אוכלוסיות של בקרות חיוביות ושליליות יכולה לשמש גם כדי להגדיר אוכלוסיות תאים חיים ואפופטוטיים כדי לקבוע שערי אוכלוסיית תאים 7,9. לאחר הגדרת מצבים תאיים חולים ובריאים, ניתן להחיל את הגדרות התבנית על כל תרביות הניסוי והביקורת הבאות.
הקפדה על פרוטוקול FC חיונית כדי למנוע תוצאות שגויות. במהלך האופטימיזציה של הפרוטוקול נצפו הבעיות הבאות: (1) ריכוז תאים נמוך, (2) ריכוז תאים גבוה, (3) גושי תאים, (4) צביעה ממושכת ו-(5) טיפול לקוי בדגימה. ניתן למנוע בעיות אלה על ידי הקפדה על דרישות פרוטוקול אופטימליות. זה מדגיש את האופי המכריע של צעדים טרום אנליטיים ואנליטיים עבור FC כדי להשיג נתונים מדויקים. במהלך הכנת התא, טריפסיניזציה, צנרת, צנטריפוגה ודילול חייבים להתבצע בזהירות. טריפסיניזציה מוגזמת ופיפטינג נמרץ עלולים לגרום לגזירה כימית ומכנית של תאים, בהתאמה. צנטריפוגה ממושכת ומהירה עלולה לגרום לפירוק תאים ולספירת פסולת תאית גבוהה. ריכוז תאים אופטימלי נדרש כדי למזער את הרכישה השגויה של אירועים תאיים. לכן, יש לדלל את מתלי התאים הראשוניים כדי להשיג ריכוז תאים אופטימלי.
יתר על כן, בעת הטיפול בדגימות, יש להקפיד למנוע גושי תאים ופיצול תאים ולהבטיח כי התאים נשארים בהשעיה במהלך הניתוח. טיפול בדגימות למניעת התגבשות תאים מאפשר זרימה של תא למינרי יחיד, מונע חסימה מכנית של צינורות הנימים של המכשיר, ועוצר אינדקסים מזויפים של גודל תא גדול. אזהרה נוספת היא הגנה על תרביות מפני אור כדי למנוע חמצון פוטו ומרווה של פלואורופורים בבדיקות כדי למנוע תוצאות שליליות כוזבות. יש להקפיד על חשיפה מינימלית לאור בשלב הצביעה של התאים ובשלבי העיבוד הבאים. יתר על כן, זמני חיסון ממושכים עלולים לגרום לתוצאות חיוביות כוזבות מכיוון שהחלבונים אינם מוכתמים באופן ספציפי. לכן, הקפדה על תקופות צביעת הדגירה שנקבעו על ידי היצרן חשובה.
לסיכום, FC יכול לזהות במדויק אפופטוזיס ולהבחין בין סמנים ביולוגיים של אפופטוזיס מוקדם ומאוחר בתרבית תאים. בנוסף, התקדמות הטכנולוגיה הובילה לייצור ציטומטרים של זרימה עבור מדענים שאינם מומחים לחקר בריאות התא ומסלולי איתות תוך-תאיים מורכבים.

אפופטוזיס, המסווג כמוות תאי מתוכנתמסוג 1 1, מבטיח שיווי משקל בין התפשטות תאים למוות תאי2. אפופטוזיס חיוני במהלך התפתחות האדם, לאחר פציעה, ולמניעת מחלות כגון סרטן3. מסלולי איתות אפופטוטיים פנימיים וחיצוניים למוות תאי4 גורמים לשינויים תוך-תאיים ביוכימיים ומורפולוגיים רציפים 2,5,6. ניתן לזהות תכונות אפופטוטיות מורפולוגיות באמצעות מיקרוסקופיה, ואת ההפרעה הביוכימית ניתן לנתח על ידי בדיקות ביוכימיות, כולל ציטומטריית זרימה (FC)7.
ניתוח ציטומטרי של זרימה לזיהוי אפופטוזיס והבנת המנגנונים התוך-תאיים הקשורים התפתח בשני העשורים האחרונים8. FC היא מתודולוגיה מדעית שמנתחת תאים בנוזל שעובר דרך לייזרים חד-ערוציים או רב-ערוציים (איור 1)9,10,11. התאים בנוזל ממוקדים לקובץ יחיד על ידי מערכת הפלואידיקה של ציטומטר הזרימה באמצעות מיקוד הידרודינמי. כאשר תאים עוברים דרך הלייזר, האור מתפזר או נפלט מהתאים. האור המפוזר יכול להיות בכיוון קדימה (פיזור קדימה) או לכיוון הצד (פיזור צד) ומספק מידע על גודל התא, גרעיניות התא או מבנים פנימיים, בהתאמה.
בנוסף, ריאגנטים פלואורסצנטיים, כגון צבעים פלואורסצנטיים או נוגדנים המסומנים בפלואורופורים, מזהים מבנים או מולקולות ספציפיים על פני השטח או תוך תאיים. כאשר הלייזר מעורר את הפלואורופורים, האור נפלט באורך גל מסוים. גלאים – בדרך כלל צינורות מכפיל אור – מכמתים את האור המפוזר והנפלט מדגימות תאים. הגלאים מייצרים זרם הניתן לכימות הפרופורציונלי לפיזור האור ולפליטת הפלואורסצנטיות. הפלט האלקטרוני מומר לאותות דיגיטליים על ידי תוכנת מחשוב לזיהוי אוכלוסיות תאים בהתבסס על גודל התא, גרעיניות התא והפלואורסצנטיות התאית היחסית של מולקולות המסומנות בפלואורופור 9,12,13.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62663/62663fig1v3.jpg"> איור 1: סכמטי המתאר את הפעולה הטכנית ואת זרימת העבודה של ציטומטריית זרימה מסורתית. תאים מוכתמים בריאגנטים פלואורסצנטיים ונבדקים על ידי לייזר. אותות הפלואורסצנטיות הנוצרים מזוהים ומומרים לפלט אלקטרוני, אשר עובר דיגיטציה נוספת ומנותח על ידי תוכנות מחשב ותוכנות סטטיסטיות. קיצורים: FSC = פיזור קדימה; SSC = פיזור צד. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62663/62663fig1v3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
FC משמש הן במחקר והן באבחון בריאות. שתי המטרות של FC בנקרוביולוגיה הן הבהרת התכונות המולקולריות והתפקודיות של מוות תאי וההבחנה בין מצבים שונים של מוות תאי 14,15,16,17,18. יישומי FC כוללים ספירת תאים, מיון אוכלוסיות תאים, אימונופנוטיפ, זיהוי סמנים ביולוגיים (למשל, סמנים ביולוגיים של אפופטוזיס), מחקרי רעילות והנדסת חלבונים12. בנוסף, FC מיושם בדרך כלל לאבחון רפואי כדי לסייע באבחון וניטור של חולים עם ממאירויות המטולוגיות. ההתקדמות במכשור, זיהוי פלואורופור ומערכות גלאים מרחיבה את יישומי FC וכוללים ציטומטריית הדמיה, ציטומטריית מסה וציטומטריה ספקטרלית עם יישומי מחקר רחבים יותר12.
הניתוח הציטומטרי של אפופטוזיס מספק יתרונות על פני טכניקות מסורתיות המשמשות להערכת בריאות התא. FC יכול לנתח תאים בודדים רבים במדגם הטרוגני במהירות ובשחזור כדי להעריך אפופטוזיס 3,5. היכולת של FC לספק מידע כמותי על פנוטיפים של תאים על בסיס תא בודד, ולהימנע מאנליזה בתפזורת, מציעה רגישות גבוהה יותר לבדיקות אימונוסורבנטיות מערביות, בדיקות אימונוסורבנטיות מקושרות אנזימים (ELISAs), פלואורומטריה וספקטרופוטומטריה המשמשות בניתוח אפופטוזיס 8,19. יתר על כן, הקלות היחסית של ניתוח FC בניגוד לצעדים הידניים המסורבלים והגרועים הניתנים לשחזור של כתמים מערביים ו- ELISAs היא יתרון. ניתוח השחזור, המדויק ובתפוקה הגבוהה של FC מועיל אפוא בחקר הסרטן20.
FC מתיר גם ניתוח סימולטני של פרמטרים של מחזור התא עבור אוכלוסיות תאים אפופטוטיים בריאות ולא תקינות21. מכיוון שאפופטוזיס הוא תהליך דינמי, שיטות שונות יכולות לייצר תוצאות משתנות ותלויות בנקודת הזמן שבה קוצרים את התאים22 . הערכה כמותית סימולטנית של פרמטרים מרובים של פנוטיפ התא מאפשרת זיהוי של תת-אוכלוסיות קטנות בדיוק גבוה, למשל, תת-קבוצות תאים נדירות בתדירות נמוכה של 0.01% ניתנות לזיהוי23. ניתוח FC רב-פרמטרי שימושי במיוחד מכיוון שמוות אפופטוטי מתרחש לאורך ספקטרום של שינויים ביוכימיים מוקדמים ומאוחרים עם תאים בנקודות שונות לאורך הרצף האפופטוטי. לדוגמה, השימוש בצביעה כפולה באמצעות Annexin V ו-propidium iodide באנליזה FC של תאים אפופטוטיים מאפשר סיווג של תאים אפופטוטיים מוקדמים, תאים אפופטוטיים מאוחרים ותאים מתים24. זיהוי מדויק של אפופטוזיס בשלבים מרובים מונע סיווג שגוי ותוצאות שליליות שגויות. לפיכך, ניתוח מולטי-פרמטרי על ידי FC משפר את הספציפיות הכוללת של זיהוי פנוטיפים של תאים ומונע סיווג שגוי של אוכלוסיות קטנות. יתר על כן, מיון תאים על ידי FC מאפשר בידוד של אוכלוסיות תאים עם טוהר גבוה לניתוח הבא7.
החיסרון של FC כולל את השימוש בתאים בתרחיף, דבר שיכול להיות מאתגר בניתוח רקמות, שכן פירוק של רקמה לתאים עלול לשנות את תפקוד התא19. יתר על כן, היעדר סטנדרטיזציה של הגדרת מכשירי FC, ניתוח נתונים ודוחות בדיקה עלול לגרום לשונות בתוצאות19, תוך הדגשת הצורך בהכשרה אופטימלית של מפעילי FC לביצוע, ניתוח ודיווח נתונים. לדוגמה, היכולת של FC להבחין בין פסולת אפופטוטית אמיתית לבין גרעינים אפופטוטיים דורשת א) הגדרות רכישה נאותות, ב) שימוש בחרוזי כיול לזיהוי שיא DNA דיפלואידי, ו-3) בקרות תאים שליליות וחיוביות שהן ספציפיות לתא3. יתר על כן, ניתוח מולטי-פרמטרי מוגבל על ידי מספר הגלאים, ויש לבצע פיצוי אופטימלי כדי למנוע תוצאות לא ספציפיות וזליגה של פליטה פלואורסצנטית בעת שימוש בריאגנטים פלואורסצנטיים מרובים25. ההתקדמות בטכנולוגיית המכשור והפלואורופור שיפרה את זיהוי הפרמטרים ל-30 פרמטרים12.
זיהוי מוות תאי אפופטוטי אינו תמיד פשוט7, ויש לקחת בחשבון סמנים ביולוגיים רגישים וספציפיים. ועדת המינוח למוות תאי (NCCD) ממליצה להשתמש ביותר מבדיקה אחת כדי לחקור ולכמת את תהליך אפופטוזיס26. ניתוח מיקרוסקופיה עבור תכונות אפופטוטיות קלאסיות26 מומלץ גם לאשר אפופטוזיס ולמנוע תוצאות חיוביות כוזבות7. ארבע תכונות ביוכימיות קרדינליות המשתרעות על פני אירועים אפופטוטיים מוקדמים ומאוחרים הן: (1) אובדן אסימטריה של קרום התא; (2) פוטנציאל פיזור הממברנה המיטוכונדריאלית (ΔΨm); (3) הפעלת קספז; (4) נזק לדנ"א26.
במהלך אפופטוזיס מוקדם, פוספטידיל-סרין מוחצן לקרום התא החיצוני 27 וניתן לזהותו על ידי Annexin V המסומן באופן פלואורסצנטי עם פיקואריתרין27,28,29. יתר על כן, צביעה כפולה עם צבע קושר DNA פלואורסצנטי, 7-aminoactinomycin D (7-AAD), מבדילה בין תאים חיים, אפופטוטיים מאוחרים ומתים. לכן, תאים אפופטוטיים מוקדמים כתם חיובי עבור Annexin V ושלילי עבור 7-AAD, בניגוד לתאים אפופטוטיים מאוחרים, כי כתם חיובי עבור שני הצבעים24.
אותות אפופטוטיים פנימיים גורמים לפיזור פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית (ΔΨm). ΔΨm המשובש גורם לשחרור חלבונים פרו-אפופטוטיים מוקדמים מחלל הקרום הבין-מיטוכונדריאלי אל הציטוזול27,29,30. ניתן להעריך את השינוי ב-ΔΨm על ידי צביעה כפולה עם הצבע הליפופילי הטעון חיובית, טטרמתילרודאמין אתיל אסטר, TMRE ו-7-AAD. צבע TMRE מצטבר בתוך הממברנה הפנימית של מיטוכונדריה שלמים כאשר פוטנציאל הממברנה גבוה. במיטוכונדריה שעברו דה-פולריזציה מדגימים ירידה בפלואורסצנטיות. תאים חיים עם מיטוכונדריה מקוטבת (קרום מיטוכונדריאלי שלם) כתם חיובי עבור TMRE ושלילי עבור 7-AAD. תאים מתים עם כתם מיטוכונדריה מקוטב שלילי עבור TMRE וחיובי עבור 7-AAD31.
הקספזות הן משפחה של פרוטאזות תוך-תאיות שכאשר הן מופעלות, מאותתות ומבצעות אפופטוזיס26,27. קספזות התליין הסופי (3,6,7) משפיעות על אפופטוזיס מאוחר 29,32,33. פעילויות קספאז-3 ו-7- ניתנות למדידה על ידי מצע מסומן פלואורסצנטית, אשר, כאשר הוא נבקע, נקשר לדנ"א ופולט אות פלואורסצנטי. יתר על כן, כל פגיעה בשלמות קרום התא ניתנת להערכה על ידי צביעה עם 7-AAD. תאים אפופטוטיים מוכתמים חיוביים עבור הצבע קושר ה- DNA אך שליליים עבור 7-AAD. תאים אפופטוטיים מאוחרים ותאים מתים כתם חיובי לשני הצבעים34.
אפופטוזיס מאוחר מאופיין על ידי נזק DNA27,29,35, אשר ניתן להעריך על ידי phosphorylated ataxiatelangiectasia מוטציה קינאז (ATM) ו היסטון H2A.X. שברי DNA דו גדילי (DSBs) לגרום phosphorylation של H2A.X. מסומן פלואורסצנטית נוגדנים נגד ATM ו- H2A. X יכול לקבוע נזק לדנ"א. זיהוי שלילי של כספומט ו- H2A. X מציין שאין נזק לדנ"א, בעוד שזיהוי שני הצבעים מצביע על נוכחות של שברים דו-גדיליים בדנ"א36.
Actinomycin D הוא גורם רב עוצמה של אפופטוזיס ופועל על ידי קשירה ל- DNA כדי לחסום אירועי שעתוק ותרגום37. מחקר זה נועד להעריך אפופטוזיס ביוכימי המושרה על ידי אקטינומיצין D בקו תאי SiHa על ידי ניתוח סמנים ביולוגיים בשלב מוקדם ומאוחר של אפופטוזיס. ארבעה סמנים ביולוגיים ביוכימיים של אפופטוזיס העריכו את השלבים העוקבים במפל אפופטוטי שכללו אובדן אסימטריה של קרום התא, שינוי בפוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית, הפעלת קספזות סופניות ונזק לדנ"א.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Lasec</td>
			<td>P1PLA044C-000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>41966052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P10-040500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guava Muse Cell Analyzer</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>0500-3115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes/Eppendorf</td>
			<td>Merck</td>
			<td>EP0030122208-200EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muse Annexin V kit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MCH100105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muse Caspase-3/7 kit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MCH100108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muse Count and Viability kit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MCH600103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muse DNA Damage kit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MCH200107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muse MitoPotential kit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MCH100110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>70013065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-strep</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SiHa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 culture flasks</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>P10-040500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis of apoptotic biomarkers in actinomycin d-treated siha cervical cancer cells

סמנים ביולוגיים של אפופטוזיס נחקרו בתאי סרטן צוואר הרחם SiHa שטופלו באקטינומיצין D באמצעות ציטומטר זרימה benchtop. סמנים ביולוגיים מוקדמים (Annexin V ופוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית) וסמנים ביולוגיים מאוחרים (קספזות 3 ו-7, ונזק לדנ"א) של אפופטוזיס נמדדו בתרביות ניסוי וביקורת. תרביות הודגרו במשך 24 שעות באינקובטור לח ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2. לאחר מכן נותקו התאים באמצעות טריפסין ונמנו באמצעות בדיקת ספירת תאים ציטומטרית של זרימה. תאים נותחו עוד יותר עבור אפופטוזיס באמצעות בדיקת Annexin V, בדיקת פוטנציאל טרנסממברנה אלקטרוכימית מיטוכונדריאלית, בדיקת קספז 3/7 ובדיקת נזק ל- DNA. מאמר זה מספק סקירה כללית של אפופטוזיס וציטומטריית זרימה מסורתית, ומפרט פרוטוקולים ציטומטריים של זרימה לעיבוד וניתוח תאי SiHa. התוצאות מתארות נתוני ניסוי חיוביים, שליליים ותת-אופטימליים. כמו כן נדונו פרשנות וסייגים בביצוע אנליזה ציטומטרית של אפופטוזיס באמצעות פלטפורמה אנליטית זו. ניתוח ציטומטרי זרימה מספק מדידה מדויקת של סמנים ביולוגיים מוקדמים ומאוחרים לאפופטוזיס.

תוצאות ספירת התאים והכדאיות (איור 3) הראו ש-95.2% מהתאים במדגם היו חיים, ו-4.8% היו מתים. ריכוז התאים הכולל במדגם המקורי היה 6.20 x 106 תאים/מ"ל.
בדיקת Annexin V ומוות תאים (איור 4) הראתה עלייה משמעותית (p < 0.0001) בתאים אפופטוטיים בתאי SiHa שטופלו ב-100 ng/mL actinomycin D בהשוואה לקבוצת הביקורת. מכיוון שצביעת Annexin V מוגברת בתאים במהלך אפופטוזיס בשלב מוקדם, ממצא זה מצביע על כך ש- 100 ng/mL actinomycin D גרמו לאפופטוזיס בתאי SiHa.
בדיקת פוטנציאל טרנסממברנה אלקטרוכימית מיטוכונדריאלית (איור 5) הדגימה ירידה משמעותית (p < 0.0001) בפרופילי בריאות התא (חיים, דה-פולריזציה וחיים, דה-פולריזציה ומתים, מתים) בין אקטינומיצין D, בקרה בינונית ובקרת ממס. נתונים אלה מצביעים על כך ש-100 ng/mL actinomycin D גרמו לדפולריזציה מיטוכונדריאלית בתאי SiHa.
בדיקת קספז 3/7 (איור 6) הדגימה הפעלה משמעותית (p < 0.0001) של קספזות 3 ו-7 בתאי SiHa שטופלו ב-100 ng/mL actinomycin D בהשוואה לקבוצת הביקורת. ממצאים אלה מראים כי 100 ng/mL actinomycin D גרם אפופטוזיס בתאי SiHa.
בדיקת נזק לדנ"א (איור 7) הראתה כי 100 ng/mL actinomycin D באופן משמעותי (p < 0.0001) גרמו לסמני נזק לדנ"א, ATM ו-H2A. X, בתאי SiHa. ממצא זה מצביע על עלייה משמעותית בנזק לדנ"א בתאי SiHa שטופלו באקטינומיצין D.
התוצאות של ניסויים תת-אופטימליים (איור 8) מדגימות שיקולים אנליטיים בכל הבדיקות. ריכוז התאים משפיע על דיוק הנתונים. באיור 8A, ספירת התאים נמוכה באופן בלתי מתקבל על הדעת. אוכלוסיות התאים המגודרות בכל 4 הרבעים של חלקת הנקודות הן בעלות עוצמת אות נמוכה. היצרן מייעל את הבדיקה עבור 300-700 תאים / μL בנפח המדגם הסופי. דוגמה זו ממחישה את חשיבות השימוש בריכוז הדגימה הנכון שנקבע על ידי היצרן.
נוסף על כך, ריכוזי תאים גבוהים גרמו גם לתוצאות שגויות (איור 8B). תרביות בינוניות וניסיוניות הדגימו 99.95% ו-100% תאים חיים, בהתאמה. קצב הזרימה של שתי הבדיקות עלה על הריכוז האופטימלי של היצרן של 100-500 תאים / μL ודרש דילול עם 1x Assay Buffer כדי למנוע ניתוח לא מדויק.
יש להימנע מהתגבשות תאים במהלך הכנת תרביות ניסיוניות מכיוון שהיא מייצרת תוצאות שגויות עקב עלייה במדדי גודל התא, כפי שמודגם במבחן נספח V. איור 8C מראה בעיה כפולה של ריכוז תאים גבוה העולה על הוראות היצרן והצטברות תאים, כפי שמעידים מדדי גודל תאים העולים על 4 בבקרה הבינונית SiHa. ריכוז התאים הגבוה מודגם על ידי יריעות של תאים היוצרים מישור אדום בוהק של תאים בתרביות בינוניות, המדגים אוכלוסיות תאים אפופטוטיות גבוהות באופן צורם.
צביעה ממושכת של תרביות עלולה לגרום לקשירה לא ספציפית של חלבונים ולגרום לתוצאות שגויות, כפי שהודגם במבחן Annexin V. איור 8D מדגים תוצאות דומות עבור תרביות בינוניות וניסיוניות עקב כתמים ממושכים.
טיפול לקוי בדגימות , טריפסיניזציה ממושכת של תאים דבקים, צנרת נמרצת במהלך שלבי שטיפה, ושלבי צנטריפוגה מהירים וממושכים גורמים לליזה של תאים ולכמויות גבוהות של פסולת תאים. באיור 8E, תרביות שנותחו על-ידי בדיקת קספז 3/7 הדגימו עלייה בפסולת התא המתבטאת באינדקס גודל תא קטן (<2.2 אינדקס גודל תא). לכן יש להקפיד בעת הכנת דגימות לאיסוף נתונים.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62663/62663fig03.jpg"> איור 3: ספירת תאים ובדיקת כדאיות. פרופיל האוכלוסייה מפריד פסולת מתאים חיים ומתים. חלקת הנקודות הדו-ממדית מגודרת ומחלקת אוכלוסיות תאים חיים ומתים. לוח המידע מספק נתונים כמותיים על ספירת תאים, אחוז מכלל התאים בני קיימא והמספר הכולל של תאים בני קיימא בדגימה. נתונים אלה יכולים לשמש כדי לתקנן את ספירת התאים בכל הדגימות עבור ניתוחי אפופטוזיס הבאים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62663/62663fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62663/62663fig04.jpg"> איור 4: נספח V assay. כל הדגימות מראות פרמטרים זהים, וניתוח סטטיסטי של כל תת-אוכלוסייה מגלה עלייה משמעותית באפופטוזיס בתאים שטופלו באקטינומיצין D. כל הבדיקות בוצעו כשלושה ניסויים עצמאיים, וכל ניסוי נבדק במשולש. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD, ו-p < 0.05 נחשב מובהק סטטיסטית. עמ' < 0.0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62663/62663fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62663/62663fig05.jpg"> איור 5: בדיקת פוטנציאל טרנסממברנה אלקטרוכימית מיטוכונדריאלית. כל הדגימות מראות פרמטרים זהים, וניתוח סטטיסטי של כל תת-אוכלוסייה מגלה הפרעה משמעותית בפוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית בתאים שטופלו באקטינומיצין D. כל הבדיקות בוצעו כשלושה ניסויים עצמאיים, וכל ניסוי נבדק במשולש. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD, ו-p < 0.05 נחשב מובהק סטטיסטית. עמ' < 0.0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62663/62663fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62663/62663fig06.jpg"> איור 6: בדיקת זיהוי קספז 3/7. כל הדגימות מראות פרמטרים זהים, וניתוח סטטיסטי של כל תת-אוכלוסייה מגלה עלייה משמעותית בפעילות קספז 3/7 בתאים שטופלו באקטינומיצין D. כל הבדיקות בוצעו כשלושה ניסויים עצמאיים, וכל ניסוי נבדק במשולש. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD, ו-p < 0.05 נחשב מובהק סטטיסטית. עמ' < 0.0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62663/62663fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62663/62663fig07.jpg"> איור 7: בדיקת נזק לדנ"א. כל הדגימות מציגות פרמטרים זהים, וניתוח סטטיסטי של כל תת-אוכלוסייה מגלה עלייה משמעותית בנזק לדנ"א דו-גדילי ונזק כולל לדנ"א בתאים שטופלו באקטינומיצין D. כל הבדיקות בוצעו בשלושה ניסויים עצמאיים, וכל ניסוי נבדק במשולש. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD, ו-p < 0.05 נחשב מובהק סטטיסטית. * עמ' < 0.05; עמ' < 0.001; עמ' < 0.0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62663/62663fig07large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62663/62663fig8v2.jpg"> איור 8: תנאי ניסוי תת-אופטימליים מניבים תוצאות גרועות . (A) ריכוז נמוך של תאים, (B) ריכוז גבוה של תאים, (C) גושים וצבירה של תאים הניכרים על ידי אינדקס גודל תאים גבוה, (D) צביעה ממושכת של דגימות תאים הניכרת על ידי צביעה חיובית מוגברת בשתי הדגימות, ו-(E) טיפול לקוי בדגימות המתבטא בפסולת תאית מוגברת (מדד גודל התא < 2.2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62663/62663fig8v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Apoptotic Biomarkers in Actinomycin D-Treated SiHa Cervical Cancer Cells at JoVE.com

Flow Cytometric Analysis of Apoptotic Biomarkers in Actinomycin D-Treated SiHa Cervical Cancer Cells

אפופטוזיס יכול להיות מאופיין על ידי ניתוח ציטומטרי זרימה של סמנים ביולוגיים אפופטוטיים מוקדמים ומאוחרים. קו תאי סרטן צוואר הרחם, SiHa, נותח עבור סמנים ביולוגיים אפופטוזיס לאחר טיפול עם Actinomycin D באמצעות ציטומטר זרימה benchtop.

ניתוח ציטומטרי זרימה של סמנים ביולוגיים אפופטוטיים בתאי סרטן צוואר הרחם SiHa שטופלו ב- Actinomycin D

Apoptosis biomarkers were investigated in actinomycin D-treated SiHa cervical cancer cells using a benchtop flow cytometer. Early biomarkers (Annexin V ...

ציטומטריית זרימה היא טכניקה רבת עוצמה המאפשרת ניתוח רב-פרמטרי של תאים בודדים. הוא יכול לזהות סמנים ביולוגיים של אפופטוזיס מוקדם ומאוחר באופן מדויק ומהיר על ידי ניתוח מיליוני תאים. מולקולות תאים מרובות מוכתמות ומזוהות בו זמנית.בפרט, ציטומטריית זרימה של ספסל עליון מאפשרת ניתוח ופרשנות על ידי ציטומטריסטים של זרימה שאינם מומחים. מי שתדגים את ההליך תהיה אסתר ג'ואו, סטודנטית לתואר שני מקבוצת הסרטן ויטמין D. התחילו בגידול תרביות התאים בסביבת CO2 לחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.ודא כי תרבית תאים היא כ 70% בבקבוק האב לפני העברת תאים לניסויים. הסר את המדיום מן הבקבוק ולשטוף את התאים עם 1X PBS. לאחר מכן להוסיף מיליליטר אחד של טריפסין כדי לנתק את התאים.לאחר שהתאים מתחילים להתנתק, נטרלו את הטריפסין על ידי הוספת כחמישה מיליליטר של מדיום תרבית טרי בתוספת נסיוב עגל עוברי 10% לפני ספירת התאים. תאי זרע ב 15, 000 תאים למיליליטר בשלושה מיליליטר של מדיום תרבית תאים בצלחת תרבית תאים שש בארות. דגרו על צלחות התרבית למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 כדי לאפשר את חיבור התאים לתחתית הבאר.למחרת, טפל בתרביות הניסוי עם 100 ננוגרם למיליליטר של אקטינומיצין D ובבקרות המדיום והממס עם מדיום תרבית טרי ו- DMSO, בהתאמה, למשך 24 שעות. הסר את המדיום מהבארות ואסוף את המדיום המשומש בצינור של 15 מיליליטר. שטפו את התאים עם 1X PBS.הוסף 500 מיקרוליטר של טריפסין כדי לנתק את התאים. יש לסובב בעדינות פיפטה אחורית מיליליטר אחד של מדיום פעמיים עד שלוש פעמים כדי לעקור מכנית את התאים הנותרים שעדיין מחוברים לתחתית הבאר. הוסף את התמיסה מהבארות לצינור של 15 מיליליטר ולאחר מכן הוסף חמישה מיליליטר של מדיום תרבית טרי כדי לנטרל את הטריפסין.פיפטה 450 מיקרוליטר של מגיב המכיל DNA מחייב צבעים בצינור מיקרוצנטריפוגה. הוסף 50 מיקרוליטר של תרחיף התא לצינור מיקרוצנטריפוגה. דוגרים על הצינור בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.ספירת התאים לפי ציטומטריית זרימה. לדלל את כל הדגימות לריכוז של אחד פעמים 10 עד התאים השישיים למיליליטר עם מדיום תרבית תאים לפני שתמשיך לבדיקות אפופטוזיס. כדי לזהות החצנה של פוספטידיל-סרין באמצעות נספחין V, יש להוסיף 100 מיקרוליטר של תרחיף תאים לצינור מיקרוצנטריפוגה.לזה, להוסיף 100 מיקרוליטר של תערובת 1: 1 של annexin מצומד פלואורסצנטי V ו 7-AAD מגיב. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות, מוגן מאור. לניתוח של דה-פולריזציה של קרום המיטוכונדריה, התחל בצנטריפוגה של 100 מיקרוליטר של תרחיף התא ב -300 פעמים G במשך חמש דקות ולאחר מכן השליך את הסופרנטנט.להשעות מחדש את התאים במיליליטר אחד של 1X PBS. הוסיפו 100 מיקרוליטר של תמיסת צביעת TMRE לכל דגימה וערבבו את המתלה על ידי פיפטינג גב עדין. עטפו את הדגימות ברדיד אלומיניום נקי כדי להגן עליהן מפני אור ודגרו על התאים במשך 20 דקות בסביבת CO2 לחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.בסוף הדגירה, להוסיף פתרון עבודה 7-AAD למדגם ולערבב אותו. כדי לזהות קספאז-3 ו-7 טרמינליים פעילים, התחל על ידי דילול הפפטיד קושר ה- DNA הקשור ל- DEVE ב- DMSO ליחס של 1:8 עם PBS 1X סטרילי כדי להפוך את פתרון זיהוי הקספז לפתרון. אחסנו את התמיסה על קרח או הוסיפו שתיים עד שמונה מעלות צלזיוס, מוגנות מפני אור.הוסף שני מיקרוליטרים של פתרון מלאי 7-AAD ל- 148 מיקרוליטר של 1X PBS כדי ליצור את פתרון העבודה 7-AAD. אחסנו את התמיסה על קרח או בשתיים עד שמונה מעלות צלזיוס, מוגנות מפני אור. צנטריפוגה 50 מיקרוליטר של התא מתלה במשך חמש דקות ב 300 פעמים G ולזרוק את supernatant.להשהות מחדש את התאים ב 50 מיקרוליטר של 1X PBS, ולאחר מכן חמישה מיקרוליטרים של פתרון זיהוי קספז עבודה ולערבב היטב. שחררו את פקק הצינורות ודגרו במשך 30 דקות בסביבת CO2 לחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, מוגנת מפני אור. הוסף 150 מיקרוליטר של פתרון העבודה 7-AAD לכל דגימה וערבב.דוגרים במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, מוגנים מפני אור. לצורך זיהוי שברי דנ"א דו-גדיליים ונזק כולל לדנ"א, יש לבצע צנטריפוגה ראשונה של 50 מיקרוליטר של תרחיף התא למשך חמש דקות ב-300 פעמים G ולהשליך את הסופר-נטנט. להשהות מחדש את התאים ב 500 מיקרוליטר של 1X PBS ולהוסיף 500 מיקרוליטר של חיץ קיבוע מבוסס פורמלדהיד ולערבב.לדגור את הדגימות על קרח במשך 10 דקות. צנטריפוגה במשך חמש דקות ב 300 פעמים G ולזרוק את supernatant. להשהות מחדש את התאים ב 90 מיקרוליטר של 1X PBS בצינור מיקרוצנטריפוגה.הוסף 10 מיקרוליטר של תמיסת הנוגדנים לצינור המיקרוצנטריפוגה. יש לדגור בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות בחושך. מוסיפים 100 מיקרוליטר של 1X PBS וצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-300 פעמים G.השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את התאים ב-200 מיקרוליטר של 1X PBS.ערבבו את הדגימה על ידי פיפטציה עדינה לאחור לפני העמסת הדגימה על ציטומטר הזרימה. אמת את הביצועים האנליטיים של ציטומטר הזרימה על ידי הפעלת ערכת בדיקת המערכת של המכשיר ואל תמשיך עם דגימות ריצה עד שכל הבדיקות יושלמו ויעבורו. ראשית, טען דגימת בקרה שלילית על ציטומטר הזרימה ובחר הפעלה, התאמת הגדרות, כך שהמכשיר יתחיל לשאוף את הדגימה ויספק תצוגה מקדימה בזמן אמת של אירועים שזוהו.באמצעות התצוגה המקדימה החיה, התאם את ערכי הסף עבור פלואורסצנטיות וגודל התא. ציירו שער מלבני סביב אוכלוסיית התא, גררו את סמן הסף כדי לא לכלול פסולת תאית ובחרו באפשרות הבא, הגדר פרופיל אפופטוזיס כדי להמשיך. הקש וגרור את סמני הרביע כדי להפריד בין אוכלוסיות התאים וכדי להתוות אירועים שזוהו בזמן אמת.השתמש בתרשימים אלה כדי להנחות את משתמש הקצה לגבי המיקום המתאים של סמני הרביע. בחר הבא, אמת הגדרות כדי להמשיך כך שהמכשיר יציג סיכום של ההגדרות. לאחר סקירת ההגדרות, בחר Next, Finish Settings כדי להחיל הגדרות אלה על כל הדגימות בניסוי.ערבבו את הדגימה הראשונה על ידי פיפטציה עדינה לאחור וטענו את הדגימה הראשונה על ציטומטר הזרימה. בחר הבא ולאחר מכן תן שם לדוגמה ובחר הפעל כך שהמערכת תתחיל להפעיל את הדגימה. במידת הצורך, בצע כוונון עדין של שערים או סמני רביע לאחר הרכישה.אתר את הניסוי הדורש התאמה על-ידי ניווט בדפדפן הקבצים של המערכת ופתח את הניסוי. הקש על התצוגה המקדימה של התמונה הממוזערת של העלילה כדי להגדיל אותה. כדי לכוונן את הסמנים המרובעים, לחץ על הצטלבות הקו האנכי והאופקי כדי להזיז את הסמנים כפי שהם, והתאם את הזווית של כל קו על-ידי לחיצה על הקו וגרירת הידית.כדי לחדד את גידור התא, לחץ על הכרטיסייה שער והתאם את מידות השער. התאם את הסמנים כרצונך והחל הגדרות אלה על כל הדגימות בניסוי על-ידי בחירת סמל סימן הביקורת, סימון כל הדגימות ובחירה באפשרות קבל. הפעל בדיקות משולשות והפעל ניתוח שונות עם מבחן בונפרוני פוסט הוק כדי להעריך הבדלים משמעותיים בין הדגימות לבקרות.ספירת התאים ותוצאות הכדאיות הראו כי 95.2% מהתאים במדגם היו חיים ו-4.8% היו מתים. ריכוז התאים נמצא 5.90 כפול 105 תאים למיליליטר. בדיקת annexin V ומוות תאים הראתה עלייה משמעותית בתאים אפופטוטיים בתאי SiHa שטופלו ב-100 ננוגרם למיליליטר אקטינומיצין D, בהשוואה לקבוצת הביקורת.בדיקת פוטנציאל טרנסממברנה אלקטרוכימית מיטוכונדריאלית הדגימה ירידה משמעותית בפרופילי בריאות התא בין actinomycin-D, בקרה בינונית ובקרת ממס, אשר הציעה כי 100 ננוגרם למיליליטר actinomycin D גרם לדפולריזציה מיטוכונדריאלית בתאי SiHa. בדיקת קספאז-3 ו-7 הדגימה הפעלה משמעותית של קספזות סופניות בתאי SiHa שטופלו ב-100 ננוגרם למיליליטר אקטינומיצין D, בהשוואה לקבוצת הביקורת. Actinomycin D גרם באופן משמעותי לסמני נזק לדנ"א, ATM, ו- H2A.X בתאי SiHa, מה שמרמז על עלייה משמעותית בנזק לדנ"א. כדי לשפר את הדיוק, הקפד לקצור את אוכלוסיית התאים הכוללת. כמו כן, יש להקפיד על ריכוזי התאים המומלצים על ידי היצרן וזמני הצביעה.ההגנה על דגימות מוכתמות מפני אור מונעת הלבנה או פלואורופורים. הניתוח הביוכימי של אפופטוזיס על ידי ציטומטריית זרימה צריך להיות נתמך על ידי מיקרוסקופיה. זה יזהה תכונות מורפולוגיות של אפופטוזיס קלאסי.התכונות כוללות עיבוי גרעיני, מיזוג קרום התא, גופים אפופטוטיים, ו karyorrhexis.

ניתוח ציטומטרי זרימה של סמנים ביולוגיים אפופטוטיים בתאי סרטן צוואר הרחם SiHa שטופלו ב- Actinomycin D

Abstract