JoVE Logo
Faculty Resource Center
Authors
Librarians
High Schools
About

Sign In

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Acknowledgements

Materials

References

Developmental Biology

الهجرة النووية في كريات الدم البيضاء Drosophila

Published: May 13th, 2021

DOI:

10.3791/62688

1Université de Paris, CNRS, Institut Jacques Monod

في Drosophila، تخضع نواة البويضات لهجرة تعتمد على الميكروتبول أثناء تكوين الخلايا. هنا، ونحن نصف البروتوكول الذي تم تطويره لمتابعة الهجرة من خلال إجراء التصوير الحي على غرف البيض السابق فيفو. يحافظ إجراءنا على غرف البيض على قيد الحياة لمدة 12 ساعة للحصول على أفلام متعددة المواقع ثلاثية الأبعاد بفاصل زمني باستخدام المجهر confocal القرص الغزل.

التصوير بالخلايا الحية ضروري بشكل خاص لفهم الآليات الخلوية والجزيئية التي تنظم حركات العضيات ، وإعادة ترتيب الهيكل الخلوي ، أو نقش القطبية داخل الخلايا. عند دراسة تحديد مواقع نواة البويضات ، تعد تقنيات التصوير الحي ضرورية لالتقاط الأحداث الديناميكية لهذه العملية. غرفة البيض Drosophila هو هيكل متعدد الخلايا ونظام نموذج ممتاز لدراسة هذه الظاهرة بسبب حجمها الكبير وتوافر العديد من الأدوات الوراثية. خلال Drosophila منتصف oogenesis ، تهاجر النواة من موقع مركزي داخل البويضات لاعتماد موقف غير متماثل بوساطة القوى المولدة من microtubule. هذه الهجرة وتحديد المواقع من النواة ضرورية لتحديد محاور القطبية للجنين وذبابة الكبار اللاحقة. إحدى خصائص هذه الهجرة هي أنها تحدث في ثلاثة أبعاد (ثلاثية الأبعاد) ، مما يخلق ضرورة للتصوير الحي. وهكذا، لدراسة الآليات التي تنظم الهجرة النووية، قمنا بتطوير بروتوكول لتنمية غرف البيض تشريح وإجراء التصوير الحي لمدة 12 ساعة عن طريق الاستحواذ الفاصل الزمني باستخدام المجهر الكونفوجال الغزل القرص. وعموما، تسمح لنا ظروفنا بالحفاظ على غرف بيض دروسوفيلا حية لفترة طويلة من الزمن، مما يمكن من تصور إتمام الهجرة النووية في عدد كبير من العينات ثلاثية الأبعاد.

لعدة سنوات، ظهرت البويضات دروسوفيلا كنظام نموذجي لدراسة الهجرة النووية. تتطور البويضات الدروسوفيليا في بنية متعددة الخلايا تسمى غرفة البيض. تشمل غرف البيض 16 خلية جرثومية (15 خلية ممرضة والبويضات) محاطة بطبقة ظهارية من الخلايا الجسدية الجريبية. تم تقسيم تطوير غرفة البيض إلى 14 مرحلة(الشكل 1A)، والتي خلالها تنمو البويضات وتتراكم الاحتياطيات اللازمة للتطور المبكر للجنين. أثناء التطوير ، عند إعادة تنظيم microtubule والنقل غير المتماثل للمحددات الأمومية ، تستقطب البويضات على طول المحاور الأمامية الظهرية والبطينية الظهرية. تحدد هذه المحاور محاور القطبية اللاحقة للجنين والبالغ الناشئة عن تخصيب هذه البويضة1.....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. التصوير إعداد المتوسطة

  1. إعداد وسائل الإعلام الطازجة في يوم الاستخدام. Pipette 200 ميكرولتر من شنايدر المتوسطة (تحتوي على L-الجلوتامين و 0.40 غرام / لتر من NaHCO3 تكملها 10٪ حرارة تعطيل مصل العجل الجنيني، 100 U/mL من البنسلين، و 100 ملغم / مل من الستريبتوميسين).
  2. تكملة مع 30 ميكرولتر من الأنسو?.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

قبل الهجرة، تكون النواة ديناميكية وتتأرجح حول موقع مركزي خلال فترة تعرف بأنها ما قبل الهجرة. تعكس هذه الحركات الصغيرة توازنا بين قوى الدفع والسحب التي تحافظ على التوازن في منتصف البويضات. ومن خلال تحديد مسارات النوى، أظهرنا أن مساري APM وLPM كان لديهما نسب مماثلة. نحن نحدد طبيعة المسار من خلا.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

بروتوكولات أخرى تصف كيفية إعداد وثقافة Drosophila البيض غرف ex vivo لتصوير حية المقايسة12,13. حداثة هذا البروتوكول هو استخدام غرفة التصوير التي شيدت باستخدام شريحة الألومنيوم مجوفة، وأغطية، وغشاء نفاذية O2/ CO2. الميزة الرئيسية لهذا الإعداد هو الحد من .......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ونحن ممتنون للغاية لجان أنطوان Lepesant ونيكولاس تيسو الذي وضع أصلا البروتوكول وتقاسم بعض العناصر الرسومية من الشكل 3 معنا. نشكر فاني رولاند جوسلين التي التقطت صور الشكل 4. كما نشكر أعضاء المختبر الآخرين على المناقشات المفيدة التي ساهمت في تحسين هذه التقنية وناثانيل هينيمان على تعليقاته التي ساعدت على تحسين هذه المخطوطة. نحن نعترف بالمنشأة الأساسية ImagoSeine التابعة لمعهد جاك مونود، عضو مؤسسة فرنسا للتصوير الحيوي (ANR-10-INBS-04). تدعم Maëlys Loh زمالة دكتوراه من وزارة البحوث الفرنسية (MESRI). تم دعم أنطوان غيشيه وفريد برنارد من قبل ARC (غرانت PJA20181208148) وجمعية Entreprises contre le Cancer (غرانت جيفلوك 2020 #221366) ومنحة ظهور من جامعة IdEx في باريس (ANR-18-IDE....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NameCompanyCatalog NumberComments
Anesthetize CO2 padDutscher789060Anesthetize flies
Coverslip (24x50 mm)Knittel GlassVD12450Y100AObservation-chamber preparation
Forceps Dumont #5Carl RothK342.1Dissection
Stainless steel needlesEntosphinx20Dissection
Heat-inactivated fetal calf serumSIGMA-ALDRICHF7524Imaging medium
Insulin solution bovine pancreasSIGMA-ALDRICH10516 - 5mlImaging medium
Penicilin/Streptomycin solutionSIGMA-ALDRICHP0781Imaging medium
Permeable membraneLeica11521746Observation-chamber preparation
Schneider MediumPan BiotechP04-91500Imaging medium
Silicon greaseBECKMAN COULTER335148Observation-chamber preparation
Spinning disk confocalZeissCSU-X1Nuclear migration observation
Voltalef oil 10SVWR24627 - 188Observation-chamber preparation

  1. Merkle, J. A., Wittes, J., Schüpbach, T. Signaling between somatic follicle cells and the germline patterns the egg and embryo of Drosophila. Current Topics in Developmental Biology. 140, 55-86 (2020).
  2. Roth, S., Lynch, J. A. Symmetry breaking during drosophila oogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (2), 001891 (2009).
  3. Bernard, F., Lepesant, J. -. A., Guichet, A. Nucleus positioning within Drosophila egg chamber. Seminars in Cell and Developmental Biology. 82, 25-33 (2017).
  4. Koch, E. A., Spitzer, R. H. Multiple effects of colchicine on oogenesis in Drosophila: Induced sterility and switch of potential oocyte to nurse-cell developmental pathway. Cell and Tissue Research. 228 (1), 21-32 (1983).
  5. Januschke, J., et al. The centrosome-nucleus complex and microtubule organization in the Drosophila oocyte. Development. 133, 129-139 (2006).
  6. Tissot, N., et al. Distinct molecular cues ensure a robust microtubule-dependent nuclear positioning in the Drosophila oocyte. Nature Communications. 8, 15168 (2017).
  7. Cetera, M., Horne-Badovinac, S. Round and round gets you somewhere: collective cell migration and planar polarity in elongating Drosophila egg chambers. Current Opinion in Genetics & Development. 32, 10-15 (2015).
  8. Hudson, A. M., Petrella, L. N., Tanaka, A. J., Cooley, L. Mononuclear muscle cells in Drosophila ovaries revealed by GFP protein traps. Developmental Biology. 314, 329-340 (2008).
  9. Gervais, L., Claret, S., Januschke, J., Roth, S., Guichet, A. PIP5K-dependent production of PIP2 sustains microtubule organization to establish polarized transport in the Drosophila oocyte. Development. 135 (23), 3829-3838 (2008).
  10. Villányi, Z., Debec, A., Timinszky, G., Tirián, L., Szabad, J. Long persistence of importin- b explains extended survival of cells and zygotes that lack the encoding gene ' n Villa. Mechanisms of Development. 3-4 (125), 196-206 (2008).
  11. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  12. Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nature Protocols. 2 (10), 2467-2473 (2007).
  13. Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (60), (2012).
  14. Chanet, S., Huynh, J. R. Collective cell sorting requires contractile cortical waves in germline cells. Current Biology. 30 (21), 4213-4226 (2020).
  15. Zhao, T., Graham, O. S., Raposo, A., St Johnston, D. Growing microtubules push the oocyte nucleus to polarize the drosophila dorsal-ventral axis. Science. 336 (6084), 999-1003 (2012).
  16. Legent, K., Tissot, N., Guichet, A. Chapter 7 Oogenesis using fixed and live imaging. Drosophila Oogenesis: Methods and Protocols. 1328, 99-112 (2015).

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved