Nuklear migration i Drosophila Oocyte

I Drosophilagennemgår oocytkernen mikrotubuleafhængig migration under oogenesis. Her beskriver vi en protokol, der blev udviklet til at følge migrationen ved at udføre live billeddannelse på ægkamre ex-vivo. Vores procedure opretholder ægkamre i live i 12 timer for at erhverve multi-position 3D time-lapse film ved hjælp af spinning-disk confocal mikroskopi.

Levende cellebilleddannelse er især nødvendig for at forstå de cellulære og molekylære mekanismer, der regulerer organelle bevægelser, cytoskeleton omlejringer eller polaritetsmønstre i cellerne. Når man studerer oocytkernepositionering, er live-imaging teknikker afgørende for at fange de dynamiske begivenheder i denne proces. Drosophila ægkammeret er en flercellet struktur og et fremragende modelsystem til at studere dette fænomen på grund af dets store størrelse og tilgængelighed af adskillige genetiske værktøjer. Under Drosophila mid-oogenesis migrerer kernen fra en central position i oocytten for at vedtage en asymmetrisk position medieret af mikrotubule-genererede kræfter. Denne migration og placering af kernen er nødvendig for at bestemme embryoets polaritetsakser og den efterfølgende voksne flue. Et karakteristisk træk ved denne migration er, at den forekommer i tre dimensioner (3D), hvilket skaber en nødvendighed for levende billeddannelse. For at studere de mekanismer, der regulerer nuklear migration, har vi således udviklet en protokol til at dyrke de dissekerede ægkamre og udføre live billeddannelse i 12 timer ved time-lapse-erhvervelser ved hjælp af spinding-disk konfokal mikroskopi. Samlet set giver vores forhold os mulighed for at bevare Drosophila ægkamre i live i lang tid, hvilket gør det muligt at visualisere færdiggørelsen af nuklear migration i et stort antal prøver i 3D.

I flere år har Drosophila oocyte vist sig som et modelsystem til at studere nuklear migration. Den Drosophila oocyt udvikler sig i en flercellet struktur kaldet ægget kammer. Æggekamre omfatter 16 kimceller (15 sygeplejerskeceller og oocytten) omgivet af et epitellag af follikulære somatiske celler. Udviklingen af æggekammeret er blevet opdelt i 14 faser (figur 1A), hvor oocyten vil vokse og akkumulere reserver, der er nødvendige for embryoets tidlige udvikling. Under udviklingen, ved mikrotubule reorganisering og asymmetrisk transport af moderlige determinanter, polariserer oocyten langs de antero-dorsale og dorso-ventr....

1. Billedbehandling medium forberedelse

1. Forbered friske medier på brugsdagen. Pipette 200 μL Schneider-medium (indeholdende L-glutamin og 0,40 g/l NaHCO₃ suppleret med 10% varmeinaktiveret føtal kalveserum, 100 U/mL penicillin og 100 mg/mL streptomycin).
2. Tillæg med 30 μL insulin 10 mg/mL.
3. Der tilsættes 4 μL varmeinaktiveret føtalkalveserum.

2. Forberedelse af observationskammer

1. Med en pipettespids påføres en lille mængde silik.......

Før overflytningen er kernen dynamisk og svinger rundt om en central position i en periode, der defineres som præmigrering. Disse små bevægelser afspejler en balance mellem at skubbe og trække kræfter, der opretholder ligevægt i midten af oocyten. Ved at kvantificere kernernes baner har vi vist, at APM- og LPM-forløbene havde lignende proportioner. Vi definerer arten af banen ved den første kontakt mellem kernen og plasmamembranen⁶. Kernen når således enten APM eller LPM, før den glide.......

Andre protokoller beskriver, hvordan man forbereder og kultur Drosophila æg kamre ex vivo for live-imaging assay^12,13. Nyheden i denne protokol er brugen af et billedkammer konstrueret ved hjælp af en udhulet aluminium dias, en coverlip, og en O₂/ CO₂ gennemtrængelig membran. Den største fordel ved dette set-up er at begrænse bevægelsen i Z uden at lægge pres på prøven. Således kan oocyten stadig bevæge sig frit, og derfo.......

Vi er meget taknemmelige over for Jean-Antoine Lepesant og Nicolas Tissot, som oprindeligt udviklede protokollen og delte nogle grafiske elementer i figur 3 med os. Vi takker Fanny Roland-Gosselin, der tog billeder af figur 4. Vi takker også andre laboratoriemedlemmer for nyttige diskussioner, der bidrog til forbedringen af denne teknik og Nathaniel Henneman for hans kommentarer, der hjalp med at forbedre dette manuskript. Vi anerkender ImagoSeine kernefaciliteten for instituttet Jacques Monod, medlem af Frankrig-BioImaging (ANR-10-INBS-04). Maëlys Loh støttes af et ph.d.-stipendium fra det franske forskningsministerium (MESRI). Antoine Guichet og Fred Bernard blev st....