Nucleaire migratie in de Drosophila Oocyte

In Drosophilaondergaat de oöcytkern microtubuli-afhankelijke migratie tijdens oogenese. Hier beschrijven we een protocol dat is ontwikkeld om de migratie te volgen door live beeldvorming uit te voeren op eierkamers ex-vivo. Onze procedure houdt de eierkamers 12 uur in leven om multi-position 3D time-lapse films te verkrijgen met behulp van spinning-disk confocale microscopie.

Live cell imaging is vooral nodig om de cellulaire en moleculaire mechanismen te begrijpen die organelbewegingen, cytoskeletherschikkingen of polariteitspatronen in de cellen reguleren. Bij het bestuderen van de positionering van oöcytenkernen zijn livebeeldvormingstechnieken essentieel om de dynamische gebeurtenissen van dit proces vast te leggen. De Drosophila-eierkamer is een meercellige structuur en een uitstekend modelsysteem om dit fenomeen te bestuderen vanwege de grote omvang en beschikbaarheid van tal van genetische hulpmiddelen. Tijdens Drosophila mid-oogenese migreert de kern vanuit een centrale positie binnen de oöcyt om een asymmetrische positie aan te nemen die wordt gemedieerd door microtubuli-gegenereerde krachten. Deze migratie en positionering van de kern zijn nodig om de polariteitsassen van het embryo en de daaropvolgende volwassen vlieg te bepalen. Een kenmerk van deze migratie is dat het plaatsvindt in drie dimensies (3D), waardoor een noodzaak voor live beeldvorming ontstaat. Om de mechanismen te bestuderen die nucleaire migratie reguleren, hebben we een protocol ontwikkeld om de ontlede eierkamers te cultuleren en live beeldvorming uit te voeren gedurende 12 uur door time-lapse-acquisities met behulp van confocale microscopie met spin-schijf. Over het algemeen stellen onze omstandigheden ons in staat om drosophila-eierkamers lange tijd in leven te houden, waardoor de voltooiing van nucleaire migratie in een groot aantal monsters in 3D kan worden gevisualiseerd.

Sinds enkele jaren is de Drosophila-oöcyt een modelsysteem om nucleaire migratie te bestuderen. De Drosophila oöcyt ontwikkelt zich in een meercellige structuur genaamd de eikamer. Eikamers omvatten 16 kiemcellen (15 verpleegstercellen en de oöcyt) omgeven door een epitheellaag van folliculaire somatische cellen. De ontwikkeling van de eikamer is onderverdeeld in 14 stadia(figuur 1A),waarin de oöcyt zal groeien en reserves zal opbouwen die nodig zijn voor de vroege ontwikkeling van het embryo. Tijdens de ontwikkeling, bij microtubulireorganisatie en asymmetrisch transport van maternale determinanten, polariseert de oöcyt....

1. Beeldvorming medium voorbereiding

1. Bereid verse media voor op de dag van gebruik. Pipet 200 μL Schneider medium (met L-Glutamine en 0,40 g/L NaHCO₃ aangevuld met 10% warmte-inactief foetale kalfsserum, 100 U/ml penicilline en 100 mg/ml streptomycine).
2. Supplement met 30 μL insuline 10 mg/ml.
3. Voeg 4 μL warmte-inactief foetale kalfsserum toe.

2. Voorbereiding observatiekamer

1. Breng met een pipettip een kleine hoeveelheid siliconenvet aa.......

Vóór de migratie is de kern dynamisch en oscilleert rond een centrale positie gedurende een periode die is gedefinieerd als pre-migratie. Deze kleine bewegingen weerspiegelen een evenwicht van duwende en trekkende krachten die het evenwicht in het midden van de oöcyt handhaven. Door de trajecten van de kernen te kwantificeren, hebben we aangetoond dat de APM- en LPM-trajecten vergelijkbare verhoudingen hadden. We definiëren de aard van het traject door het eerste contact tussen de kern en het plasmamembraan

Andere protocollen beschrijven hoe drosophila-eierkamers ex vivo kunnen worden voorbereid en gekweekt voor live-imaging assay^12,13. De nieuwigheid van dit protocol is het gebruik van een beeldvormingskamer die is gebouwd met behulp van een uitgeholde aluminium schuif, een afdeklip en een O₂/ CO₂ doorlatend membraan. Het belangrijkste voordeel van deze opstelling is om de beweging in Z te beperken zonder druk uit te oefenen op het mo.......

We zijn Jean-Antoine Lepesant en Nicolas Tissot zeer dankbaar die het protocol oorspronkelijk ontwikkelden en enkele grafische elementen van figuur 3 met ons deelden. We danken Fanny Roland-Gosselin die de foto's van figuur 4 heeft gemaakt. We danken ook andere lableden voor nuttige discussies die hebben bijgedragen aan de verbetering van deze techniek en Nathaniel Henneman voor zijn opmerkingen die hebben bijgedragen aan het verbeteren van dit manuscript. We erkennen de ImagoSeine kernfaciliteit van het Instituut Jacques Monod, lid van France-BioImaging (ANR-10-INBS-04). Maëlys Loh wordt ondersteund door een doctoraatsbeurs van het Franse ministerie van Onderzoek (ME....