הגירה גרעינית באוקיטה של דרוסופילה

בדרוסופילה, גרעין הביצית עובר הגירה תלוית מיקרוטובולה במהלך oogenesis. כאן, אנו מתארים פרוטוקול שפותח כדי לעקוב אחר הנדידה על ידי ביצוע הדמיה חיה על תאי ביצה ex-vivo. ההליך שלנו שומר על תאי ביצים בחיים במשך 12 שעות כדי לרכוש סרטים תלת-ממדיים רב-תכליתיים לשגות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של דיסק מסתובב.

הדמיית תאים חיים נחוצה במיוחד כדי להבין את המנגנונים התאיים והמולקולריים המווסתים את תנועות האברונים, סידורים מחדש של ציטוסקלטון או דפוסי קוטביות בתוך התאים. בעת לימוד מיקום גרעין oocyte, טכניקות הדמיה חיה חיוניות כדי ללכוד את האירועים הדינמיים של תהליך זה. תא הביצים Drosophila הוא מבנה רב תאי ומערכת מודל מעולה ללמוד תופעה זו בשל גודלה הגדול וזמינות של כלים גנטיים רבים. במהלך Drosophila באמצע oogenesis, הגרעין נודד מעמדה מרכזית בתוך oocyte לאמץ עמדה אסימטרית בתיווך כוחות שנוצרו microtubule. נדידה זו ומיצוב הגרעין נחוצים כדי לקבוע את צירי הקוטביות של העובר ואת הזבוב הבוגר הבא. מאפיין אחד של הגירה זו הוא שהיא מתרחשת בשלושה ממדים (3D), יצירת צורך בהדמיה חיה. לכן, כדי לחקור את המנגנונים המסדירים הגירה גרעינית, פיתחנו פרוטוקול כדי לתרבות את תאי הביצים נותחו ולבצע הדמיה חיה במשך 12 שעות על ידי רכישות בזמן לשגות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של דיסק מסתובב. בסך הכל, התנאים שלנו מאפשרים לנו לשמר את תאי הביצים של Drosophila בחיים במשך תקופה ארוכה של זמן, ובכך לאפשר את השלמת ההגירה הגרעינית להיות לדמיין במספר רב של דגימות בתלת-ממד.

במשך מספר שנים, ביצינה Drosophila התפתח כמערכת מודל לחקר הגירה גרעינית. הביצית הדרוזופילה מתפתחת במבנה רב תאי הנקרא תא הביצים. תאי הביצה מקיפים 16 תאי נבט (15 תאי אחות וביציות) מוקפים בשכבה אפיתל של תאים סומטיים זקיקים. פיתוח תאי הביצים מחולק ל-14 שלבים (איור 1A),שבמהלכם הביצית תגדל ותצבר עתודות הדרושות להתפתחות מוקדמת של העובר. במהלך ההתפתחות, עם ארגון מחדש של מיקרוטובולות והובלה אסימטרית של דטרמיננטים אימהיים, הביציות מקוטבות לאורך הצירים האנטרו-דורסלים והדורסו-גחון. צירים אלה קובעים את צירי הקוטביות הבאים של העובר ואת המבוגר הנובע מהפריה של הביצית¹. במהלך אוגנזה, הגרעין מאמץ עמדה אסימטרית בביצי....

1. הדמיה הכנה בינונית

1. הכן מדיה טרייה ביום השימוש. פיפט 200 μL של בינוני שניידר (המכיל L-גלוטמין ו 0.40 גרם / ליטר של NaHCO₃ בתוספת 10% סרום עגל עוברי מומת בחום, 100 U / mL של פניצילין, ו 100 מ"ג / מ"ל של סטרפטומיצין).
2. תוספת עם 30 μL של אינסולין 10 מ"ג/מ"ל.
3. יש להוסיף 4 מיקרו-אל של סרום עגל עוברי מו?.......

לפני ההעברה, הגרעין דינמי ומתנדנד סביב מיקום מרכזי בתקופה המוגדרת כקדם-העברה. תנועות קטנות אלה משקפות איזון של דחיפה ומשיכת כוחות השומרים על שיווי משקל באמצע ביציות. על ידי כימות המסלולים של הגרעינים, הראינו כי מסלולי APM ו- LPM היו פרופורציות דומות. אנו מגדירים את אופי המסלול על ידי המגע הראש.......

פרוטוקולים אחרים מתארים כיצד להכין ולתרבות תאי הביצה Drosophila ex vivo לבדיקת הדמיה חיה^12,13. החידוש של פרוטוקול זה הוא השימוש בתא הדמיה שנבנה באמצעות מגלשת אלומיניום חלולה, כיסוי, וקרום חדיר O₂/ CO_2. היתרון העיקרי של מערך זה הוא להגביל את התנועה ב- Z מבל.......

אנו מודים מאוד לז'אן אנטואן לפסאנט וניקולס טיסוט שפיתחו את הפרוטוקול במקור ושיתפו איתנו כמה אלמנטים גרפיים של איור 3. אנו מודים לפאני רולנד-גוסלין שצילמה את התמונות של איור 4. אנו מודים גם לחברי מעבדה אחרים על דיונים מועילים שתרמו להחמצת טכניקה זו ונתנאל הנמן על הערותיו שעזרו לשפר את כתב היד הזה. אנו מכירים במתקן הליבה של ImagoSeine של המכון ז'אק מונוד, חבר בצרפת-BioImaging (ANR-10-INBS-04). מאליס לו נתמך על ידי מלגת דוקטורט ממשרד המחקר הצרפתי (MESRI). אנטואן Guichet ופרד ברנרד נתמכו על ידי ARC (גרנט PJA20181208148), האגודה des Entreprises contre le Cancer (גרנט Gefluc 2020 #221366) ועל ידי מענק הופעתה מאוניברסיטת IdEx דה פריז (ANR-18-IDEX-0001).