Migrazione nucleare nell'ovocita di Drosophila

In Drosophila, il nucleo dell'ovocita subisce una migrazione microtubule-dipendente durante l'oogenesi. Qui, descriviamo un protocollo che è stato sviluppato per seguire la migrazione eseguendo l'imaging dal vivo su camere di uova ex-vivo. La nostra procedura mantiene in vita le camere delle uova per 12 ore per acquisire filmati time-lapse 3D multi-posizione utilizzando la microscopia confocale a disco rotante.

L'imaging di cellule vive è particolarmente necessario per comprendere i meccanismi cellulari e molecolari che regolano i movimenti degli organelli, i riarrangiamenti del citoscheletro o il pattern di polarità all'interno delle cellule. Quando si studia il posizionamento del nucleo ovocitario, le tecniche di live-imaging sono essenziali per catturare gli eventi dinamici di questo processo. La camera dell'uovo Di Drosophila è una struttura multicellulare e un eccellente sistema modello per studiare questo fenomeno a causa delle sue grandi dimensioni e della disponibilità di numerosi strumenti genetici. Durante la Mid-oogenesi della Drosophila, il nucleo migra da una posizione centrale all'interno dell'ovocita per adottare una posizione asimmetrica mediata da forze generate da microtubuli. Questa migrazione e il posizionamento del nucleo sono necessari per determinare gli assi di polarità dell'embrione e della successiva mosca adulta. Una caratteristica di questa migrazione è che si verifica in tre dimensioni (3D), creando una necessità per l'imaging dal vivo. Pertanto, per studiare i meccanismi che regolano la migrazione nucleare, abbiamo sviluppato un protocollo per la coltura delle camere delle uova sezionate ed eseguire l'imaging dal vivo per 12 ore mediante acquisizioni time-lapse utilizzando la microscopia confocale a disco rotante. Nel complesso, le nostre condizioni ci consentono di preservare in vita le camere delle uova di Drosophila per un lungo periodo di tempo, consentendo così di visualizzare il completamento della migrazione nucleare in un gran numero di campioni in 3D.

Per diversi anni, l'ovocita Drosophila è emerso come un sistema modello per studiare la migrazione nucleare. L'ovocita Drosophila si sviluppa in una struttura multicellulare chiamata camera dell'uovo. Le camere degli ovuli comprendono 16 cellule germinali (15 cellule nutrici e l'ovocita) circondate da uno strato epiteliale di cellule somatiche follicolari. Lo sviluppo della camera d'uovo è stato suddiviso in 14 fasi (Figura 1A), durante le quali l'ovocita crescerà e accumulerà le riserve necessarie per lo sviluppo precoce dell'embrione. Durante lo sviluppo, dopo la riorganizzazione dei microtubuli e il trasporto asimmetr....

1. Preparazione del mezzo di imaging

1. Preparare supporti freschi il giorno dell'uso. Pipetta 200 μL di mezzo Schneider (contenente L-Glutammina e 0,40 g/L di NaHCO₃ integrati con il 10% di siero fetale per polpaccio inattivato dal calore, 100 U/mL di penicillina e 100 mg/mL di streptomicina).
2. Integratore con 30 μL di insulina 10 mg/mL.
3. Aggiungere 4 μL di siero fetale per polpaccio inattivato dal calore.

2. Preparazione della camera di osservazione.......

Prima della migrazione, il nucleo è dinamico e oscilla attorno a una posizione centrale durante un periodo definito come pre-migrazione. Questi piccoli movimenti riflettono un equilibrio di forze di spinta e trazione che mantengono l'equilibrio nel mezzo dell'ovocita. Quantificando le traiettorie dei nuclei, abbiamo dimostrato che le traiettorie APM e LPM avevano proporzioni simili. Definiamo la natura della traiettoria dal primo contatto tra il nucleo e la membrana plasmatica⁶. Pertanto, il nucl.......

Altri protocolli descrivono come preparare e coltura le camere per uova di Drosophila ex vivo per il saggio di imaging dal vivo^12,13. La novità di questo protocollo è l'uso di una camera di imaging costruita utilizzando un vetrino di alluminio cavo, un coverslip e una membrana permeabile A O₂/ CO_2. Il vantaggio principale di questa configurazione è quello di limitare il movimento in Z senza esercitare pressione sul campione. Pert.......

Siamo estremamente grati a Jean-Antoine Lepesant e Nicolas Tissot che hanno originariamente sviluppato il protocollo e condiviso con noi alcuni elementi grafici della Figura 3. Ringraziamo Fanny Roland-Gosselin che ha scattato le foto della Figura 4. Ringraziamo anche gli altri membri del laboratorio per le discussioni utili che hanno contribuito al miglioramento di questa tecnica e Nathaniel Henneman per i suoi commenti che hanno contribuito a migliorare questo manoscritto. Riconosciamo la struttura principale di ImagoSeine dell'Istituto Jacques Monod, membro di France-BioImaging (ANR-10-INBS-04). Maëlys Loh è supportato da una borsa di dottorato del Ministero della ....