ショ ウジョウバエ・ ウーサイトにおける核移動

ショウジョウバエでは、卵母細胞核は卵発生時に微小管依存性の移動を受ける。ここでは、卵室ex-vivoでライブイメージングを行うことで、移行に追随するために開発されたプロトコルについて説明します。私たちの手順は、スピニングディスク共焦点顕微鏡を使用してマルチポジション3Dタイムラプス映画を取得するために12時間生きている卵室を維持します。

生細胞イメージングは、細胞内の細胞内の運動、細胞骨格の再編成、または極性のパターン形成を調節する細胞および分子メカニズムを理解するために特に必要です。卵母細胞核の位置決めを研究する際には、このプロセスの動的事象を捉えるためには、ライブイメージング技術が不可欠です。 ショウジョウバエ の卵室は多細胞構造であり、多数の遺伝的ツールの大きなサイズと可用性のために、この現象を研究するための優れたモデルシステムです。ショ ウジョウバエ 中発性の間に、核は卵母細胞内の中央位置から移行し、微小管生成力によって媒介される非対称的な位置を採用する。この核の移動および位置決めは、胚およびそれ以降の成体フライの極性軸を決定するために必要である。この移行の特徴の1つは、3次元(3D)で発生し、ライブイメージングの必要性を生み出すことである。このように、核移動を制御するメカニズムを研究するために、解剖された卵室を培養し、スピニングディスク共焦点顕微鏡を用いたタイムラプス取得により12時間のライブイメージングを行うプロトコルを開発しました。全体的に、我々の条件は、我々は長期間生きている ショウジョウバエ の卵室を維持することを可能にし、それによって核移動の完了を3Dの多数のサンプルで視覚化することを可能にする。

数年前から、ショウジョウバエの卵母細胞は核移動を研究するモデルとして登場してきた。ショウジョウバエの卵母細胞は、卵室と呼ばれる多細胞構造で発達する。卵室は、卵胞体細胞の上皮層に囲まれた16個の生殖細胞(15個のナース細胞および卵母細胞)を包含する。卵室の発達は14段階(図1A)に細分化されており、その間に卵母細胞が成長し、胚の早期発達に必要な埋蔵量を蓄積する。開発中、母体決定因子の微小管再編成および非対称輸送時に、卵母細胞は前側側および側腹側の軸に沿って偏光する。これらの軸は、この卵母細胞¹の受精に起因する胚および成体のその後の極性軸を決定する。卵発の間、核は卵母細胞で非対称的な位置を採用する。ステージ6では、核は細胞の中心となる。卵母細胞が受け取る後濾胞細胞によって発されるシグナルがまだ同定されていない時に、核はステージ7の前部と横形質膜の交点に向かって移動する(図1B)2、3。この非対称位置は、ドーソ側腹筋軸の決定を誘導するために必要である。

1. イメージング媒体製剤

1. 使用当日に新鮮なメディアを準備します。シュナイダー培地のピペット200 μL(NaHCO₃ のL-グルタミンおよび0.40 g/Lを含み、10%の熱不活性化胎児仔血清、100 U/mLのペニシリン、および100mg/mLのストレプトマイシンを補完した)。
2. 30 μLのインスリン 10 mg/mL を補います。
3. 熱不活性化胎児の子牛の血清の4 μLを加える。

2. 観?.......

移行前に、核は動的であり、移行前と定義された期間の中心位置の周りに振動します。これらの小さな動きは、卵母細胞の真ん中に平衡を維持する押しと引き力のバランスを反映しています。核の軌跡を定量化することで、APMとLPMの軌道の割合が同じであることを示しました。我々は、核と原形質膜⁶との間の最初の接触によって軌道の性質を定義する。したがって、核は、.......

他のプロトコルは、ショウジョウバエ卵室ex vivoを生画像アッセイ^12,13に対して調製および培養する方法を説明する。このプロトコルの目新しさは、くり抜かれたアルミニウムスライド、カバースリップ、およびO_{2 /CO2}透過膜を使用して構築されたイメージングチャンバーの使用である。このセットアップの主な利点は、サンプ.......

もともとプロトコルを開発し、図3のグラフィカルな要素を共有してくれたジャン=アントワンヌ・ルペサンとニコラ・ティソに非常に感謝しています。図4の写真を撮ったファニー・ローランド=ゴセリンに感謝します。また、この技術の改善に貢献した有益な議論と、この原稿の改善に役立ったナサニエル・ヘネマンのコメントに対する他の研究室メンバーに感謝します。我々は、フランスバイオイメージング(ANR-10-INBS-04)のメンバーであるジャック・モノド研究所のイマゴセイン・コア・ファシリティを認める。マエリス・ローは、フランス研究省(MESRI)の博士課程のフェローシップに支えられている。アントワン・ギシェとフレッド・バーナードは、ARC(グラントPJA20181208148)、アントレ・ル・ガン(グラント・ゲフルック2020#221366)、イデックス・ユニバーシクル・ド・パリ(ANR-18-IDEX-0001)の出現助成金によって支えられました。