Kjernefysisk migrasjon i Drosophila Oocyte

I Drosophilagjennomgår oocyttkjernen mikrotubulavhengig migrasjon under oogenese. Her beskriver vi en protokoll som ble utviklet for å følge migrasjonen ved å utføre levende avbildning på eggkamre ex-vivo. Vår prosedyre opprettholder eggkamre i live i 12 timer for å skaffe seg 3D-tidsforløpfilmer med flere posisjoner ved hjelp av konfektmikroskopi med spinnende disk.

Levende celleavbildning er spesielt nødvendig for å forstå de cellulære og molekylære mekanismene som regulerer organelle bevegelser, cytoskjelett omorganiseringer eller polaritetsmønster i cellene. Når du studerer oocyttkjerneposisjonering, er live-imaging teknikker avgjørende for å fange opp de dynamiske hendelsene i denne prosessen. Drosophila eggkammer er en multicellulær struktur og et utmerket modellsystem for å studere dette fenomenet på grunn av sin store størrelse og tilgjengelighet av mange genetiske verktøy. Under Drosophila midt-oogenese migrerer kjernen fra en sentral posisjon i oocytten for å vedta en asymmetrisk posisjon formidlet av mikrotubulegenererte krefter. Denne migrasjonen og plasseringen av kjernen er nødvendig for å bestemme polaritetsøksene til embryoet og den etterfølgende voksne fly. Et kjennetegn ved denne overføringen er at den forekommer i tre dimensjoner (3D), noe som skaper en nødvendighet for levende avbildning. For å studere mekanismene som regulerer kjernefysisk migrasjon, har vi derfor utviklet en protokoll for å dyrke de dissekerte eggkamrene og utføre levende avbildning i 12 timer ved tidsforløpoppkjøp ved hjelp av spinnende disk konfokal mikroskopi. Samlet sett tillater våre forhold oss å bevare Drosophila eggkamre i live i lang tid, og dermed muliggjøre fullføring av kjernefysisk migrasjon som skal visualiseres i et stort antall prøver i 3D.

I flere år har Drosophila-oocytten dukket opp som et modellsystem for å studere kjernefysisk migrasjon. Drosophila oocytten utvikler seg i en multicellulær struktur kalt eggkammeret. Eggkamre omfatter 16 bakterieceller (15 sykepleierceller og oocytten) omgitt av et epitellag av follikulære somatiske celler. Eggkammerutvikling har blitt delt inn i 14 stadier (Figur 1A), hvor oocytten vil vokse og akkumulere reserver som er nødvendige for den tidlige utviklingen av embryoet. Under utviklingen, ved mikrotubul omorganisering og asymmetrisk transport av mors determinanter, polariserer oocytten langs antero-dorsale og dorso-ve....

1. Bildebehandling medium forberedelse

1. Forbered ferske medier på bruksdagen. Pipette 200 μL Schneider medium (inneholder L-Glutamine og 0,40 g/l NaHCO₃ supplert med 10% varmeinaktivert fosterkalvserum, 100 U/ml penicillin og 100 mg/ml streptomycin).
2. Supplement med 30 μL insulin 10 mg/ml.
3. Tilsett 4 μL varmeinaktivert fosterkalvserum.

2. Forberedelse av observasjonskammer

1. Med pipettespiss kan du påføre en liten mengde silikonfett run.......

Før migrasjon er kjernen dynamisk og svinger rundt en sentral posisjon i en periode definert som forflytting. Disse små bevegelsene gjenspeiler en balanse mellom å presse og trekke krefter som opprettholder likevekt midt i oocytten. Ved å kvantifisere banene til kjernene har vi vist at APM- og LPM-banene hadde lignende proporsjoner. Vi definerer banens natur ved første kontakt mellom kjernen og plasmamembranen⁶. Dermed når kjernen enten APM eller LPM før den glir langs den, for å nå sin e.......

Andre protokoller beskriver hvordan du forbereder og kultur Drosophila eggkamre ex vivo for live-imaging analyse^12,13. Nyheten i denne protokollen er bruken av et bildekammer konstruert ved hjelp av en uthulet aluminiumssklie, en dekslelip og en O₂/ CO₂ gjennomtrengelig membran. Den største fordelen med dette oppsettet er å begrense bevegelsen i Z uten å utøve press på prøven. Dermed kan oocytten fortsatt bevege seg fritt, og .......

Vi er svært takknemlige for Jean-Antoine Lepesant og Nicolas Tissot som opprinnelig utviklet protokollen og delte noen grafiske elementer i figur 3 med oss. Vi takker Fanny Roland-Gosselin som tok bildene av figur 4. Vi takker også andre laboratoriemedlemmer for nyttige diskusjoner som bidro til ameliorasjonen av denne teknikken og Nathaniel Henneman for hans kommentarer som bidro til å forbedre dette manuskriptet. Vi anerkjenner ImagoSeine kjerneanlegget til instituttet Jacques Monod, medlem av France-BioImaging (ANR-10-INBS-04). Maëlys Loh støttes av et stipendiat fra det franske forskningsdepartementet (MESRI). Antoine Guichet og Fred Bernard ble støttet av ARC (Gr....