Migração Nuclear no Oócito de Drosophila

Em Drosophila,o núcleo oócito sofre migração dependente de microtúbulos durante a oogênese. Aqui, descrevemos um protocolo que foi desenvolvido para acompanhar a migração realizando imagens ao vivo em câmaras de ovos ex-vivo. Nosso procedimento mantém as câmaras de ovos vivas por 12 horas para adquirir filmes de lapso de tempo 3D multi-posição usando microscopia confocal de disco giratório.

A imagem de células vivas é particularmente necessária para entender os mecanismos celulares e moleculares que regulam movimentos de organela, rearranjos de citoesqueleto ou padronagem de polaridade dentro das células. Ao estudar o posicionamento do núcleo oócito, as técnicas de imagem ao vivo são essenciais para capturar os eventos dinâmicos desse processo. A câmara de ovos Drosophila é uma estrutura multicelular e um excelente sistema modelo para estudar esse fenômeno devido ao seu grande tamanho e disponibilidade de inúmeras ferramentas genéticas. Durante a oogênese média de Drosophila, o núcleo migra de uma posição central dentro do oócito para adotar uma posição assimétrica mediada por forças geradas por microtúbulos. Essa migração e posicionamento do núcleo são necessários para determinar os eixos de polaridade do embrião e da mosca adulta subsequente. Uma característica dessa migração é que ela ocorre em três dimensões (3D), criando uma necessidade de imagem viva. Assim, para estudar os mecanismos que regulam a migração nuclear, desenvolvemos um protocolo para cultivar as câmaras de ovos dissecadas e realizar imagens ao vivo por 12h por aquisições de lapso de tempo usando microscopia confocal de disco giratório. No geral, nossas condições nos permitem preservar as câmaras de ovos de Drosophila vivas por um longo período de tempo, permitindo assim que a conclusão da migração nuclear seja visualizada em um grande número de amostras em 3D.

Por vários anos, o oócito Drosophila emergiu como um sistema modelo para estudar a migração nuclear. O oócito Drosophila desenvolve-se em uma estrutura multicelular chamada câmara de ovos. Câmaras de ovos abrangem 16 células germinativas (15 células enfermeiras e o oócito) cercadas por uma camada epitelial de células somáticas foliculares. O desenvolvimento da câmara de ovos foi subdividido em 14 etapas (Figura 1A), durante as quais o oócito crescerá e acumulará reservas necessárias para o desenvolvimento precoce do embrião. Durante o desenvolvimento, após a reorganização microtúbula e o transporte assimétrico de determi....

1. Preparação média de imagem

1. Prepare novas mídias no dia do uso. Pipeta 200 μL de meio Schneider (contendo L-Glutamina e 0,40 g/L de NaHCO₃ complementado com soro fetal de bezerro inativado 10%, 100 U/mL de penicilina e 100 mg/mL de estreptomicina).
2. Suplemento com 30 μL de insulina 10 mg/mL.
3. Adicione 4 μL de soro fetal inativado a calor.

2. Preparação da câmara de observação

1. Com uma ponta de pipeta, aplique uma pequena quant.......

Antes da migração, o núcleo é dinâmico e oscila em torno de uma posição central durante um período definido como pré-migração. Esses pequenos movimentos refletem um equilíbrio de forças de empurrar e puxar que mantêm o equilíbrio no meio do oócito. Ao quantificar as trajetórias dos núcleos, mostramos que as trajetórias APM e LPM apresentaram proporções semelhantes. Definimos a natureza da trajetória pelo primeiro contato entre o núcleo e a membrana plasmática⁶. Assim, o nú.......

Outros protocolos descrevem como preparar e cultivar câmaras de ovos Drosophila ex vivo para ensaio de imagem ao vivo^12,13. A novidade deste protocolo é o uso de uma câmara de imagem construída usando um slide de alumínio oco, um deslizamento de tampa e uma membrana permeável O₂/CO_2. A principal vantagem desta configuração é limitar o movimento em Z sem exercer pressão sobre a amostra. Assim, o oócito ainda pode se mover .......

Somos extremamente gratos a Jean-Antoine Lepesant e Nicolas Tissot que originalmente desenvolveram o protocolo e compartilharam alguns elementos gráficos da Figura 3 conosco. Agradecemos a Fanny Roland-Gosselin que tirou as fotos da Figura 4. Agradecemos também a outros membros do laboratório por discussões úteis que contribuíram para a amenização desta técnica e Nathaniel Henneman por seus comentários que ajudaram a melhorar este manuscrito. Reconhecemos a instalação central ImagoSeine do Instituto Jacques Monod, membro da France-BioImaging (ANR-10-INBS-04). Maëlys Loh é apoiada por uma bolsa de doutorado do Ministério da Pesquisa francês (MESRI). Antoine Guichet e F....