Ядерная миграция в ооците дрозофилы

При дрозофилеядро ооцита подвергается микротрубочезависимой миграции во время оогенеза. Здесь мы описываем протокол, который был разработан для отслеживания миграции путем выполнения живой визуализации на камерах яиц ex-vivo. Наша процедура поддерживает яйцеклетки живыми в течение 12 часов для получения многопозиционных 3D-покадровых фильмов с использованием конфокальной микроскопии с вращающимся диском.

Визуализация живых клеток особенно необходима для понимания клеточных и молекулярных механизмов, которые регулируют движения органелл, перестройки цитоскелетов или паттерны полярности внутри клеток. При изучении позиционирования ядра ооцита методы визуализации в реальном времени необходимы для захвата динамических событий этого процесса. Яичная камера дрозофилы представляет собой многоклеточную структуру и отличную модельную систему для изучения этого явления из-за ее большого размера и наличия многочисленных генетических инструментов. Во время среднего оогенеза дрозофилы ядро мигрирует из центрального положения в ооците, чтобы принять асимметричное положение, опосредованное силами, генерируемыми микротрубочами. Такая миграция и позиционирование ядра необходимы для определения осей полярности эмбриона и последующей взрослой мухи. Одной из характеристик этой миграции является то, что она происходит в трех измерениях (3D), создавая необходимость для живой визуализации. Таким образом, для изучения механизмов, регулирующих ядерную миграцию, мы разработали протокол культивирования расчлененных яйцеклеток и выполнения живой визуализации в течение 12 ч путем покадровых приобретений с использованием конфокальной микроскопии со спиннинговым диском. В целом, наши условия позволяют нам сохранять яйцеклетки дрозофилы живыми в течение длительного периода времени, тем самым позволяя визуализировать завершение ядерной миграции в большом количестве образцов в 3D.

В течение нескольких лет ооцит дрозофилы появился в качестве модельной системы для изучения ядерной миграции. Ооцит дрозофилы развивается в многоклеточной структуре, называемой камерой яйцеклетки. Яйцеклетки охватывают 16 половых клеток (15 клеток-кормилиц и яйцеклетку), окруженных эпителиальным слоем фолликулярных соматических клеток. Развитие яичной камеры было подразделено на 14 стадий(рисунок 1А),в ходе которых яйцеклетка будет расти и накапливать запасы, необходимые для раннего развития эмбриона. При развитии, при реорганизации микротрубочек и асимметричном переносе материнских детерминант, ооцит поляризуется по ант....

1. Подготовка среды визуализации

1. Приготовьте свежие средства в день использования. Пипетка 200 мкл среды Schneider (содержащая L-глютамин и 0,40 г/л NaHCO_3, дополненная 10% термоинактивированной сывороткой для телят плода, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина).
2. Добавка с 30 мкл .......

До миграции ядро является динамичным и колеблется вокруг центрального положения в течение периода, определяемого как предмиграции. Эти небольшие движения отражают баланс толкающих и тянущих сил, которые поддерживают равновесие в середине ооцита. Количественно измещая траектории яде.......

Другие протоколы описывают, как подготовить и культивировать камеры яиц дрозофилы ex vivo для анализа живой визуализации^12,13. Новизна этого протокола заключается в использовании камеры визуализации, построенной с использованием полого алюминиевого с?.......

Мы чрезвычайно благодарны Жану-Антуану Лепесанту и Николя Тиссо, которые первоначально разработали протокол и поделились с нами некоторыми графическими элементами рисунка 3. Мы благодарим Фанни Роланд-Госселин, которая сделала фотографии рисунка 4. Мы также благодарим других членов лаборатории за полезные обсуждения, которые способствовали улучшению этой техники, и Натаниэля Хеннемана за его комментарии, которые помогли улучшить эту рукопись. Мы выражаем признательность за базовую установку ImagoSeine Института Жака Моно, члена France-BioImaging (ANR-10-INBS-04). Маэли Ло поддерживается стипендией PhD от Министерства исследований Франции (MESRI). Антуан Гише и Фред Бе....