Migración nuclear en el ovocito Drosophila

En Drosophila,el núcleo de ovocitos sufre una migración dependiente de microtúbulos durante la oogénesis. Aquí, describimos un protocolo que se desarrolló para seguir la migración mediante la realización de imágenes en vivo en cámaras de óvulos ex-vivo. Nuestro procedimiento mantiene vivas las cámaras de huevos durante 12 h para adquirir películas de lapso de tiempo 3D multi posición utilizando microscopía confocal de disco giratorio.

Las imágenes de células vivas son particularmente necesarias para comprender los mecanismos celulares y moleculares que regulan los movimientos de los orgánulos, los reordenamientos del citoesqueleto o el patrón de polaridad dentro de las células. Al estudiar el posicionamiento del núcleo de ovocitos, las técnicas de imágenes en vivo son esenciales para capturar los eventos dinámicos de este proceso. La cámara de huevos de Drosophila es una estructura multicelular y un excelente sistema modelo para estudiar este fenómeno debido a su gran tamaño y disponibilidad de numerosas herramientas genéticas. Durante la oogénesis media de Drosophila, el núcleo migra desde una posición central dentro del ovocito para adoptar una posición asimétrica mediada por fuerzas generadas por microtúbulos. Esta migración y posicionamiento del núcleo son necesarios para determinar los ejes de polaridad del embrión y la posterior mosca adulta. Una característica de esta migración es que ocurre en tres dimensiones (3D), creando una necesidad de imágenes en vivo. Así, para estudiar los mecanismos que regulan la migración nuclear, hemos desarrollado un protocolo para cultivar las cámaras de óvulos diseccionadas y realizar imágenes en vivo durante 12 h mediante adquisiciones time-lapse mediante microscopía confocal de disco giratorio. En general, nuestras condiciones nos permiten preservar las cámaras de huevos de Drosophila vivas durante un largo período de tiempo, lo que permite visualizar la finalización de la migración nuclear en una gran cantidad de muestras en 3D.

Durante varios años, el ovocito Drosophila ha surgido como un sistema modelo para estudiar la migración nuclear. El ovocito Drosophila se desarrolla en una estructura multicelular llamada cámara de óvulos. Las cámaras de óvulos abarcan 16 células germinales (15 células nodriza y el ovocito) rodeadas por una capa epitelial de células somáticas foliculares. El desarrollo de la cámara de óvulos se ha subdividido en 14 etapas(Figura 1A),durante las cuales el ovocito crecerá y acumulará las reservas necesarias para el desarrollo temprano del embrión. Durante el desarrollo, tras la reorganización de los microtúbulos y el trans....

1. Preparación del medio de imagen

1. Prepare medios frescos el día de su uso. Pipeta 200 μL de medio Schneider (que contiene L-glutamina y 0,40 g/L de NaHCO₃ complementada con suero de ternero fetal inactivado al 10% por calor, 100 U/ml de penicilina y 100 mg/ml de estreptomicina).
2. Suplemento con 30 μL de insulina 10 mg/ml.
3. Añadir 4 μL de suero fetal de ternero inactivado por calor.

2. Preparación de la cámara de observación

1. Con u.......

Antes de la migración, el núcleo es dinámico y oscila alrededor de una posición central durante un período definido como pre-migración. Estos pequeños movimientos reflejan un equilibrio de fuerzas de empuje y tracción que mantienen el equilibrio en el medio del ovocito. Al cuantificar las trayectorias de los núcleos, hemos demostrado que las trayectorias APM y LPM tenían proporciones similares. Definimos la naturaleza de la trayectoria por el primer contacto entre el núcleo y la membrana plasmática

Otros protocolos describen cómo preparar y cultivar cámaras de huevos de Drosophila ex vivo para el ensayo de imágenes en vivo^12,13. La novedad de este protocolo es el uso de una cámara de imagen construida con una corredera de aluminio ahuecado, un coverslip y una membrana permeable A O₂/ CO_2. La principal ventaja de esta configuración es limitar el movimiento en Z sin ejercer presión sobre la muestra. Por lo tanto, el ovocit.......

Estamos extremadamente agradecidos a Jean-Antoine Lepesant y Nicolas Tissot que originalmente desarrollaron el protocolo y compartieron algunos elementos gráficos de la Figura 3 con nosotros. Agradecemos a Fanny Roland-Gosselin que tomó las fotos de la Figura 4. También agradecemos a otros miembros del laboratorio por las útiles discusiones que contribuyeron a la mejora de esta técnica y a Nathaniel Henneman por sus comentarios que ayudaron a mejorar este manuscrito. Reconocemos la instalación central de ImagoSeine del Instituto Jacques Monod, miembro de France-BioImaging (ANR-10-INBS-04). Maëlys Loh cuenta con el apoyo de una beca de doctorado del Ministerio de Inves....