Nukleär migration i Drosophila Oocyte

I Drosophilagenomgår oocytekärnan mikrotubuleberoende migration under oogenes. Här beskriver vi ett protokoll som utvecklades för att följa migreringen genom att utföra levande avbildning på äggkammare ex-vivo. Vår procedur upprätthåller äggkammare levande i 12 h för att förvärva flerpositions 3D-timelapse-filmer med spinndiskkonfokal mikroskopi.

Levande celltomografi är särskilt nödvändigt för att förstå de cellulära och molekylära mekanismer som reglerar organellrörelser, cytoskeletonomorganiseringar eller polaritetsmönster i cellerna. När man studerar oocytkärna positionering, live-imaging tekniker är avgörande för att fånga de dynamiska händelserna i denna process. Drosophila äggkammare är en multicellulär struktur och ett utmärkt modellsystem för att studera detta fenomen på grund av dess stora storlek och tillgänglighet av många genetiska verktyg. Under Drosophila mid-oogenesis migrerar kärnan från en central position inom äggoiden för att anta en asymmetrisk position medierad av mikrotubule-genererade krafter. Denna migration och positionering av kärnan är nödvändiga för att bestämma embryots polaritetsaxlar och den efterföljande vuxna flugan. En egenskap hos denna migrering är att den förekommer i tre dimensioner (3D), vilket skapar en nödvändighet för live-avbildning. För att studera mekanismerna som reglerar nukleär migration har vi därför utvecklat ett protokoll för att odla de dissekerade äggkamrarna och utföra levande avbildning i 12 timmar genom timelapse-förvärv med spinndiskkonfokal mikroskopi. Sammantaget tillåter våra förhållanden oss att bevara Drosophila äggkammare levande under en lång tid, vilket gör det möjligt att slutföra nukleär migration i ett stort antal prover i 3D.

I flera år har Drosophila-äggoiden dykt upp som ett modellsystem för att studera nukleär migration. Drosophila oocyte utvecklas i en multicellulär struktur som kallas äggkammaren. Äggkammare omfattar 16 könsceller (15 sjuksköterskeceller och oocyt) omgivna av ett epiteliallager av follikulära somatiska celler. Äggkammarutvecklingen har delats in i 14 steg (figur 1A), under vilken äggcellen kommer att växa och ackumulera reserver som är nödvändiga för embryots tidiga utveckling. Under utvecklingen, vid mikrotubule omorganisering och asymmetrisk transport av moderns bestämningsfaktorer, polariseras oocyten längs antero-dor....

1. Förberedelse av bildmedium

1. Förbered nya medier på användningsdagen. Pipett 200 μL Schneider medium (innehållande L-glutamin och 0,40 g/L NaHCO₃ kompletterad med 10% värmeinaktiverat fosterkalvserum, 100 U/ml penicillin och 100 mg/ml streptomycin).
2. Tillägg med 30 μL insulin 10 mg/ml.
3. Tillsätt 4 μL värmeinaktiverat fosterkalvserum.

2. Förberedelse av observationskammare

1. Applicera en liten mängd silikonfett runt hålet på .......

Före migreringen är kärnan dynamisk och svänger runt en central position under en period som definieras som förmigrering. Dessa små rörelser återspeglar en balans mellan att trycka och dra krafter som upprätthåller jämvikt i mitten av äggcellen. Genom att kvantifiera kärnornas banor har vi visat att APM- och LPM-banorna hade liknande proportioner. Vi definierar banans natur genom den första kontakten mellan kärnan och plasmamembranet⁶. Således når kärnan antingen APM eller LPM in.......

Andra protokoll beskriver hur man förbereder och odlar Drosophila äggkammare ex vivo för live-imaging assay^12,13. Nyheten med detta protokoll är användningen av en bildkammare konstruerad med hjälp av en ihålig aluminiumrutschbana, ett täckglas och ett O₂/ CO₂ genomsläppligt membran. Den största fördelen med denna uppsättning är att begränsa rörelsen i Z utan att utöva tryck på provet. Således kan äggcellen fortfa.......

Vi är oerhört tacksamma mot Jean-Antoine Lepesant och Nicolas Tissot som ursprungligen utvecklade protokollet och delade några grafiska element i figur 3 med oss. Vi tackar Fanny Roland-Gosselin som tog bilderna på figur 4. Vi tackar också andra labbmedlemmar för hjälpsamma diskussioner som bidrog till förbättringen av denna teknik och Nathaniel Henneman för hans kommentarer som hjälpte till att förbättra detta manuskript. Vi erkänner ImagoSeine kärnanläggningen vid institutet Jacques Monod, medlem av France-BioImaging (ANR-10-INBS-04). Maëlys Loh stöds av ett doktorandstipendium från det franska forskningsministeriet (MESRI). Antoine Guichet och Fred Bernard stöddes ....