Drosophila Oosyte'de Nükleer Göç

Drosophila'da, oosit çekirdeği oogenez sırasında mikrotübül bağımlı göçe uğrar. Burada, yumurta odaları ex-vivo üzerinde canlı görüntüleme yaparak göçü takip etmek için geliştirilen bir protokolü açıklıyoruz. Prosedürümüz, iplik disk konfokal mikroskopi kullanarak çok konumlu 3D hızlandırılmış filmler elde etmek için yumurta odalarını 12 saat boyunca canlı tutar.

Canlı hücre görüntüleme, özellikle organel hareketleri, sitoskeleton yeniden düzenlemelerini veya hücre içindeki polarite desenlerini düzenleyen hücresel ve moleküler mekanizmaları anlamak için gereklidir. Oosit çekirdek konumlandırmasını incelerken, bu sürecin dinamik olaylarını yakalamak için canlı görüntüleme teknikleri gereklidir. Drosophila yumurta odası, çok hücreli bir yapıdır ve çok sayıda genetik aletin büyüklüğü ve mevcudiyeti nedeniyle bu fenomeni incelemek için mükemmel bir model sistemidir. Drosophila orta-oogenez sırasında çekirdek, mikrotübül tarafından oluşturulan kuvvetlerin aracılık ettiği asimetrik bir pozisyonu benimsemek için oosit içindeki merkezi bir konumdan göç eder. Çekirdeğin bu göçü ve konumlandırılması, embriyonun ve sonraki yetişkin sineğinin polarite eksenlerini belirlemek için gereklidir. Bu geçişin bir özelliği, canlı görüntüleme için bir gereklilik yaratan üç boyutta (3D) gerçekleşmesidir. Böylece, nükleer göçü düzenleyen mekanizmaları incelemek için, parçalanmış yumurta odalarını kültüre etmek ve iplik disk konfokal mikroskopi kullanarak zaman atlamalı alımlarla 12 saat boyunca canlı görüntüleme yapmak için bir protokol geliştirdik. Genel olarak, koşullarımız Drosophila yumurta odalarını uzun süre canlı tutmamıza izin verir, böylece nükleer göçün tamamlanmasının 3D olarak çok sayıda örnekte görselleştirilmesini sağlar.

Birkaç yıldır, Drosophila oosit nükleer göçü incelemek için bir model sistem olarak ortaya çıkmıştır. Drosophila oosit yumurta odası adı verilen çok hücreli bir yapıda gelişir. Yumurta odaları, foliküler somatik hücrelerin epitel tabakası ile çevrili 16 mikrop hücresini (15 hemşire hücresi ve oosit) kapsar. Yumurta odası gelişimi, oositin büyüyeceği ve embriyonun erken gelişimi için gerekli rezervleri biriktireceği 14 aşamaya (Şekil 1A) ayrılmıştır. Gelişim sırasında, maternal determinantların mikrotübül reorganasyonu ve asimetrik taşınması üzerine, oosit antero-dorsal ve dorso-ventral eksenler boyunca polarize eder. Bu ....

1. Görüntüleme ortamı hazırlığı

1. Kullanım gününde taze medya hazırlayın. Pipet 200 μL Schneider ortamı (L-Glutamin ve 0.40 g/L NaHCO₃ içeren% 10 ısı inaktive fetal baldır serumu, 100 U / mL penisilin ve 100 mg / mL streptomisin ile tamamlanır).
2. 30 μL insülin ile takviye 10 mg / mL.
3. 4 μL ısı inaktive fetal baldır serumu ekleyin.

2. Gözlem odası hazırlığı

1. Pipet ucu ile delinmiş slaydın alt tarafındaki deli.......

Göç öncesi, çekirdek dinamiktir ve göç öncesi olarak tanımlanan bir dönemde merkezi bir konum etrafında salınır. Bu küçük hareketler, oosit ortasında dengeyi koruyan itme ve çekme kuvvetleri dengesini yansıtır. Çekirdeklerin yörüngelerini ölçerek, APM ve LPM yörüngelerinin benzer oranlara sahip olduğunu gösterdik. Yörüngenin doğasını çekirdek ve plazma zarı arasındaki ilk temasla tanımlıyoruz⁶. Böylece, çekirdek, iki plazma zarının kesişimindeki son konum.......

Diğer protokoller, Drosophila yumurta odalarının canlı görüntüleme için ex vivo'nun nasıl hazırlanacağını ve kültüre edilmesini açıklar^12,13. Bu protokolün yeniliği, içi boş bir alüminyum kaydırak, bir kapak kılıfı ve bir O₂/CO₂ geçirgen membran kullanılarak inşa edilen bir görüntüleme odasının kullanılmasıdır. Bu kurulumun ana avantajı, numuneye baskı uygulamadan Z'deki hareketi sınırlamakt?.......

Protokolü geliştiren ve Şekil 3'ün bazı grafik öğelerini bizimle paylaşan Jean-Antoine Lepesant ve Nicolas Tissot'a son derece minnettarız. Şekil 4'ün fotoğraflarını çeken Fanny Roland-Gosselin'e teşekkür ederiz. Ayrıca bu tekniğin iyileştirilmesine katkıda bulunan yararlı tartışmalar için diğer laboratuvar üyelerine ve bu makalenin geliştirilmesine yardımcı olan yorumları için Nathaniel Henneman'a teşekkür ederiz. Fransa-Biyoimaging (ANR-10-INBS-04) üyesi Jacques Monod Enstitüsü'nün ImagoSeine çekirdek tesisini kabul ediyoruz. Maëlys Loh, Fransa Araştırma Bakanlığı'ndan (MESRI) doktora bursu ile desteklenmektedir. Antoine Guichet ve Fred Bernard ARC (Grant PJA2018120....