Funcionalização vesícula extracelular derivada de plaquetas de implantes ti

Resumo

Aqui, apresentamos um método para o isolamento de Vesículas Extracelulares (EVs) derivados das plaquetas (PL) e seu uso para revestimento de superfícies de implante de titânio (Ti). Descrevemos o método de revestimento de fundição de gota, o perfil de liberação de EVs das superfícies e a biocompatibilidade in vitro de superfícies Ti revestidas de EVs.

Resumo

Vesículos extracelulares (EVs) são nanovesculas biológicas que desempenham um papel fundamental na comunicação celular. Seu conteúdo inclui biomoléculas ativas, como proteínas e ácidos nucleicos, que apresentam grande potencial na medicina regenerativa. Mais recentemente, os EVs derivados de Plaqueta Lysate (PL) mostraram uma capacidade osteogênica comparável ao PL. Além disso, os biomateriais são frequentemente utilizados em ortopedia ou restauração dentária. Aqui, fornecemos um método para funcionalizar superfícies ti com EVs derivados de PL, a fim de melhorar suas propriedades osteogênicas.

Os EVs são isolados do PL por cromatografia de exclusão de tamanho, e depois as superfícies ti são funcionalizadas com PL-EVs por fundição de gota. A funcionalidade é comprovada pela liberação de EVs e sua biocompatibilidade pelo ensaio de liberação de lactato desidrogenase (LDH).

Introdução

Os EVs são vesículas de membrana (30-200 nm) secretadas por qualquer célula e desempenham um papel fundamental na comunicação célula-celular, entregando sua carga. Eles contêm uma variedade de biomoléculas ativas que podem incluir ácidos nucleicos, fatores de crescimento ou lipídios bioativos1. Por essas razões, os EVs têm sido avaliados por seu potencial uso na terapêutica. Em termos de ortopedia e regeneração óssea, EVs de diferentes fontes foram testados. Entre eles, os EVs derivados de plaquetas têm sido mostrados para induzir um efeito de diferenciação sobre as células-tronco, mantendo um perfil citotóxico ^baixo2,3<....

Protocolo

A plaqueta Lysate (PL) é obtida como descrito anteriormente em conformidade com as diretrizes ^{institucionais3} utilizando casacos de buffy fresco fornecidos pelo IdISBa Biobank como material inicial. Sua utilização para o projeto atual foi aprovada pelo Comitê de Ética (IB 1995/12 BIO).

1. Isolamento de EVs do PL

1. Remoção de corpos maiores
   1. Descongelar PL em temperatura ambiente.
   2. Centrifugar PL a 1.500 x g para 15 min a 4 °C. Descarte a pelota, pois contém detritos celulares.
   3. Colete o supernatante e realize duas centrífugas consecutivas a 10.000 x g por 30 min a....

Resultados

O método apresentado neste artigo permite a obtenção de discos de titânio funcionalizados EVs. Os EVs são fisicamente ligados à superfície, o que permite uma liberação sustentada ao longo do tempo. A quantidade de EVs liberados pode ser medida pela NTA nos dias 2, 6, 10 e 14. As primeiras medições, no dia 2, mostram que cerca de ¹⁰⁹ EVs são lançados, seguidos de uma liberação sustentada no dia 6 (~¹⁰⁸ EVs); dia 10 (~¹⁰⁷ EVs) e dia 14 (~¹⁰⁷ EVs). Isso confirma uma.......

Discussão

Este protocolo visa fornecer instruções claras para a funcionalização dos EVs nas superfícies ti. O método apresentado baseia-se em uma estratégia de fundição de gota, que é um tipo de funcionalização de fissionação. A má bibliografia existe em relação à funcionalização de EVs nas superfícies de Ti, embora existam poucos estudos mostrando diferentes vantagens ao imobilizar EVs no ^Ti10. De qualquer forma, algumas das estratégias exploradas incluem ligação bioquímica8, armad.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,8 µm syringe filter	Sartorius	16592K
1.5 mL Centrifuge tube	SPL life sciences	PLC60015
1mL syringe	BD	303174
96-well culture plate	SPL life sciences	PLC30096
Absolut ethanol	Scharlau	ET0006005P	Used to prepare 20 %  ethanol with Milli-Q® water
AKTA purifier System	GE Healthcare	8149-30-0014
Allegra X-15R Centrifuge	Beckman Coutler	392934	SX4750A swinging rotor
Centrifuge 5430 R	Eppendorf	5428000210	F-45-48-11 rotor
Conical Tube, Conical Bottom, 50ml	SPL life sciences	PLC50050
Cytotoxicity Detection Kit (LDH)	Roche	11644793001
Disposable Syringes 10 ml	Becton Dickinson	BDH307736
DMEM Low Glucose Glutamax	GIBCO	21885025
Dulbecco's PBS (1x)	Capricorn Scientific	PBS-1A
Fetal Bovine Serum (FBS) Embrionic Certified	GIBCO	16000044
Filtropur S 0.2 µm syringe filter	Sarstedt	83.1826.001
HiPrep 16/60 Sephacryl S-400 HR	GE Healthcare	28-9356-04	Precast columns
human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (hUC-MSC)	IdISBa Biobank
Nanodrop 2000 spectrophotometer	ThermoFisher	ND-2000
NanoSight NS300 nanoparticle tracking analysis	Malvern	NS300	Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS
Needle	Terumo	946077135
Nitric acid 69,5%	Scharlau	AC16071000
Optima L-100 XP Ultracentrifuge	Beckman Coulter	8043-30-1124	SW-32Ti Rotor
Penicillin-Streptomycin Solution 100X	Biowest	L0022
pH Test strips 4.5-10.0	Sigma	P-4536
Platelet Lysate (PL)	IdISBa Biobank		Obtained from  buffy coats discarded after blood donation
Polypropylene centrifuge tubs	Beckman Coutler	326823
Power wave HT	BioTek	10340763
Screw cap tube, 15 ml, (LxØ): 120 x 17 mm, PP, with print	Sarstedt	62554502
Sodium hidroxide	Sharlau	SO04251000
Titanium implants replicas	Implantmedia, SA	NA	Titanium grade IV. Diameter: 6,2 mm. Height: 1,95 mm
Trypsin-EDTA 1 X	Biowest	L0930
Tryton X100	Sigma	T8787