Algoritmo di analisi delle immagini basato sull'area per la quantificazione delle cocolture di macrofagi-fibroblasti

Riepilogo

Presentiamo un metodo che utilizza un approccio di analisi delle immagini generalizzabile basato sull'area per identificare i conteggi delle cellule. L'analisi di diverse popolazioni cellulari ha sfruttato le significative differenze di altezza e struttura cellulare tra diversi tipi di cellule all'interno di un algoritmo adattivo.

Abstract

La quantificazione delle cellule è necessaria per una vasta gamma di studi biologici e biochimici. L'analisi convenzionale delle immagini delle cellule impiega in genere approcci di rilevamento della fluorescenza, come la colorazione immunofluorescente o la trasfezione con proteine fluorescenti o tecniche di rilevamento dei bordi, che sono spesso soggette a errori a causa del rumore e di altre non idealità nello sfondo dell'immagine.

Abbiamo progettato un nuovo algoritmo in grado di contare e distinguere con precisione macrofagi e fibroblasti, cellule di diversi fenotipi che spesso colocalizzano durante la rigenerazione dei tessuti. MATLAB è stato utilizzato per implementare l'algoritmo, che differenziava tipi di celle distinti in base alle differenze di altezza dallo sfondo. Un algoritmo primario è stato sviluppato utilizzando un metodo basato sull'area per tenere conto delle variazioni nelle dimensioni / struttura delle cellule e nelle condizioni di semina ad alta densità.

Le non idealità nelle strutture cellulari sono state spiegate con un algoritmo secondario iterativo che utilizza parametri interni come la copertura cellulare calcolata utilizzando dati sperimentali per un determinato tipo di cellula. Infine, è stata effettuata un'analisi degli ambienti di cocoltura utilizzando un algoritmo di isolamento in cui sono stati esclusi selettivamente vari tipi di cellule in base alla valutazione delle differenze di altezza relative all'interno dell'immagine. Questo approccio è stato trovato per contare accuratamente le cellule entro un margine di errore del 5% per le cellule monocolturate e all'interno di un margine di errore del 10% per le cellule cocolturate.

Introduzione

Il software viene regolarmente implementato durante le tecniche di analisi delle immagini per garantire che i risultati siano accurati, efficienti e imparziali. Per i saggi basati su cellule, un problema comune è l'errata identificazione delle cellule. Le immagini con impostazioni focali e di contrasto improprie possono portare alla sfocatura delle cellule, in cui il confine delle singole cellule diventa difficile da identificare¹. La presenza di caratteristiche dell'immagine estranee come pori, bolle o altri oggetti indesiderati può ostacolare le procedure di conteggio rallentando il processo di conteggio e portando a un'errata identificazione....

Protocollo

1. Coltura cellulare e acquisizione di immagini

1. Coltura di macrofagi RAW264.7 a 37 °C e 5% CO₂ nel Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco integrato con il 10% di siero bovino fetale (FBS), l'1% di penicillina-streptomicina, 1,5 g/L di bicarbonato di sodio e 5 μM di β-mercaptoetanolo.
   1. Per l'imaging in monocoltura, coltivare cellule RAW264.7 ad una densità di 25.000 cellule/cm² in un pallone di coltura cellulare da 5 ml con 1 mL di terreno.
2. Coltura di cellule NIH/3T3 a 37 °C e 5% di CO₂ in DMEM integrate con il 10% di siero bovino fetale e l'1% di penicillina-streptomicina

Risultati

L'analisi dei macrofagi RAW264.7 non bulbosi è stata condotta in un ambiente di monocoltura a 25.000 cellule / cm². Sono state scattate immagini rappresentative della coltura cellulare ed elaborate in MATLAB dopo la conversione in tiff a 8 bit in ImageJ. Gli output dell'algoritmo durante tutto il processo sono stati registrati e documentati nella Figura 2 per l'immagine rappresentativa. In questa immagine, l'algoritmo ha contato 226 celle e questo conteggio delle immagini è stat.......

Discussione

Abbiamo progettato una procedura generale basata sull'area che contava in modo accurato ed efficiente le cellule sulla base dell'altezza delle cellule, consentendo una quantificazione senza macchie delle cellule anche nei sistemi di cocoltura. I passaggi critici per questa procedura includevano l'implementazione di un sistema di intensità relativa mediante il quale le cellule potevano essere differenziate. L'uso di un'analisi dell'altezza relativa serviva a due scopi: la necessità di parametri esterni era resa superflu.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Axio Observer 7 Inverted Microscope	Zeiss	1028290770
β-mercaptoethanol	Life Technologies	21985023
Cell Scrapers	CellTreat	229310
Dublecco's Modified Eagle Medium	Fisher Scientific	12430047
Dublecco's PBS	Fisher Scientific	14190144
MATLAB Software	MathWorks	2021A
NIH/3T3 Cells	ATCC	ATCC CRL - 1658
Penicillin–Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333-20ML
RAW264.7 Cells	ATCC	ATCC TIB - 71
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S6014-25G
T75 Cell Culture Flask	Corning	CLS3814-24EA