透過処理検出機能付き連続フローマイクロエレクトロポレーションシステムの構築と運用

このプロトコルでは、ラボオンチップのマイクロ流体エレクトロポレーションデバイスを構築するために必要な微細加工技術について説明します。実験セットアップは、制御された単一細胞レベルのトランスフェクションを連続フローで実行し、集団ベースの制御により、より高いスループットに拡張することができます。細胞膜透過の程度をリアルタイムで電気的に監視する機能を示す分析が提供されます。

CAR-T細胞療法などの現在の治療革新は、ウイルスを介した遺伝子送達に大きく依存しています。この技術は効率的ですが、製造コストが高いため、遺伝子導入に代替方法を使用することに関心が寄せられています。エレクトロポレーションは、遺伝子やその他の外因性物質の細胞内送達のための電気物理学的非ウイルス的アプローチです。電界を印加すると、細胞膜は一時的に細胞内への分子送達を可能にする。典型的には、エレクトロポレーションは、多数の細胞を処理するためにマクロスケールで実行される。ただし、このアプローチでは広範な経験的プロトコル開発が必要であり、初代細胞タイプやトランスフェクションが困難な細胞タイプを扱う場合はコストがかかります。長いプロトコル開発は、細胞を透過するのに十分な電界強度を達成するための大きな電圧の要件と相まって、マイクロスケールのエレクトロポレーションデバイスの開発につながりました。これらのマイクロエレクトロポレーションデバイスは、一般的な微細加工技術を使用して製造されており、高いスループット能力を維持する可能性のある、より優れた実験制御を可能にします。この研究は、連続フロー下で単一細胞レベルで細胞膜透過処理のレベルを検出できるマイクロ流体エレクトロポレーション技術を構築しています。しかし、この技術は毎秒4セルの処理に制限されていたため、システムのスループットを向上させるための新しいアプローチが提案され、ここで提示されます。この新しい手法は、細胞集団ベースのフィードバック制御と呼ばれ、さまざまなエレクトロポレーションパルス条件に対する細胞透過応答を考慮し、テスト対象の細胞タイプに最適なエレクトロポレーションパルス条件を決定します。次に、この「最適な」パルスが輸送中の細胞懸濁液に適用されるハイスループットモードが使用されます。デバイスの作製、マイクロ流体実験のセットアップと実行、および結果の分析の手順が詳細に示されています。最後に、このマイクロエレクトロポレーション技術は、緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードするDNAプラスミドをHEK293細胞に送達することによって実証されます。

CAR-T(キメラ抗原受容体改変T細胞)細胞療法やCRISPR(クラスター化された規則的に間隔を空けた短い回文反復DNA配列)/Cas9を使用した遺伝子編集など、生物医学研究における現在の治療革新は、外因性物質を細胞内空間にうまく効率的に送達する能力に大きく依存しています¹。CAR-T療法において、細胞治療製造における遺伝子送達工程を行うゴールドスタンダードは、ウイルス^{ベクター2}を用いることである。ウイルス媒介遺伝子送達は効率的な送達モダリティであるが、いくつかの欠点もある。これらには、製造コスト、細胞毒性、免疫原性、突然変異誘発/腫瘍形成の可能性、および送達される遺伝子のサイズ制限が含まれます³。これらの制限は、代替の非ウイルス送達技術の研究開発につながっています。

ウイルスを介した遺伝子送達に代わるエレクトロポレーションは、細胞のDNA、RNA、およびタンパク質トランスフェクションを実行するために、最適な電気パルス波形の適用に依存しています。外部電界の適用後、細胞膜は一時的に損なわれ、細胞は、そうでなければ不透過性の外因性物質の細胞内送達の影響を受けやすくなる⁴。ウイルス媒介送達と比較して、エレクトロポレーションは、一般的に安全で、操作が容易で、運用コストが低いため、有利です。エレク....

注意: ユーザーは、このプロトコルで使用されている材料と消耗品について、すべてのMSDSを確認する必要があります。各ステップで適切なPPEを着用し、実験中に滅菌技術を使用する必要があります。セクション1〜7では、デバイスの製造について説明します。

1.デバイス製造-マスク設計

注:微細加工プロセスの図については、

図4は、単一パルス振幅に対する単一細胞レベルの膜透過処理検出の背後にある動作原理を示しています。エレクトロポレーション実験の開始後、細胞検出アルゴリズムは、ポイントごとのスロープベースの検出方法を介して、細胞検出に最適な閾値を決定します。次に、システムは、セルの進入を示す測定された電流の有意な負の変化について(1)を継続的に監視します.......

このプロトコル内で提示される方法論は、主にマイクロ流体デバイスの微細加工に焦点を当てており、その後、特殊なエレクトロポレーション実験セットアップに統合されます。微細加工プロセスの詳細を説明するときによく使用される「レシピ」という用語は、機能するデバイスを正常に製造するために各ステップに従う/最適化することの重要性を示唆しています。ただし、UV露光時間/エ.......

著者らは、全米科学財団(NSF CBET 0967598、DBI IDBR 1353918)および米国教育省の精密および個別化医療の新興分野における大学院トレーニング(P200A150131)による、大学院生J.J.S.のフェローシップへの資金提供に対する財政的支援に感謝したいと思います。