透過処理検出機能付き連続フローマイクロエレクトロポレーションシステムの構築と運用

要約

このプロトコルでは、ラボオンチップのマイクロ流体エレクトロポレーションデバイスを構築するために必要な微細加工技術について説明します。実験セットアップは、制御された単一細胞レベルのトランスフェクションを連続フローで実行し、集団ベースの制御により、より高いスループットに拡張することができます。細胞膜透過の程度をリアルタイムで電気的に監視する機能を示す分析が提供されます。

要約

CAR-T細胞療法などの現在の治療革新は、ウイルスを介した遺伝子送達に大きく依存しています。この技術は効率的ですが、製造コストが高いため、遺伝子導入に代替方法を使用することに関心が寄せられています。エレクトロポレーションは、遺伝子やその他の外因性物質の細胞内送達のための電気物理学的非ウイルス的アプローチです。電界を印加すると、細胞膜は一時的に細胞内への分子送達を可能にする。典型的には、エレクトロポレーションは、多数の細胞を処理するためにマクロスケールで実行される。ただし、このアプローチでは広範な経験的プロトコル開発が必要であり、初代細胞タイプやトランスフェクションが困難な細胞タイプを扱う場合はコストがかかります。長いプロトコル開発は、細胞を透過するのに十分な電界強度を達成するための大きな電圧の要件と相まって、マイクロスケールのエレクトロポレーションデバイスの開発につながりました。これらのマイクロエレクトロポレーションデバイスは、一般的な微細加工技術を使用して製造されており、高いスループット能力を維持する可能性のある、より優れた実験制御を可能にします。この研究は、連続フロー下で単一細胞レベルで細胞膜透過処理のレベルを検出できるマイクロ流体エレクトロポレーション技術を構築しています。しかし、この技術は毎秒4セルの処理に制限されていたため、システムのスループットを向上させるための新しいアプローチが提案され、ここで提示されます。この新しい手法は、細胞集団ベースのフィードバック制御と呼ばれ、さまざまなエレクトロポレーションパルス条件に対する細胞透過応答を考慮し、テスト対象の細胞タイプに最適なエレクトロポレーションパルス条件を決定します。次に、この「最適な」パルスが輸送中の細胞懸濁液に適用されるハイスループットモードが使用されます。デバイスの作製、マイクロ流体実験のセットアップと実行、および結果の分析の手順が詳細に示されています。最後に、このマイクロエレクトロポレーション技術は、緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードするDNAプラスミドをHEK293細胞に送達することによって実証されます。

概要

CAR-T(キメラ抗原受容体改変T細胞)細胞療法やCRISPR(クラスター化された規則的に間隔を空けた短い回文反復DNA配列)/Cas9を使用した遺伝子編集など、生物医学研究における現在の治療革新は、外因性物質を細胞内空間にうまく効率的に送達する能力に大きく依存しています¹。CAR-T療法において、細胞治療製造における遺伝子送達工程を行うゴールドスタンダードは、ウイルス^{ベクター2}を用いることである。ウイルス媒介遺伝子送達は効率的な送達モダリティであるが、いくつかの欠点もある。これらには、製造コスト、細胞毒性、免疫原性、突然変異誘発/腫瘍形成の可能性、および送達される遺伝子のサイズ制限が含まれます³。これらの制限は、代替の非ウイルス送達技術の研究開発につながっています。

ウイルスを介した遺伝子送達に代わるエレクトロポレーションは、細胞のDNA、RNA、およびタンパク質トランスフェクションを実行するために、最適な電気パルス波形の適用に依存しています。外部電界の適用後、細胞膜は一時的に損なわれ、細胞は、そうでなければ不透過性の外因性物質の細胞内送達の影響を受けやすくなる⁴。ウイルス媒介送達と比較して、エレクトロポレーションは、一般的に安全で、操作が容易で、運用コストが低いため、有利です。エレク....

プロトコル

注意: ユーザーは、このプロトコルで使用されている材料と消耗品について、すべてのMSDSを確認する必要があります。各ステップで適切なPPEを着用し、実験中に滅菌技術を使用する必要があります。セクション1〜7では、デバイスの製造について説明します。

1.デバイス製造-マスク設計

注:微細加工プロセスの図については、 図2 を参照してください。微細加工ステップは、クリーンルーム環境で実施する必要があります。追加のPPEが必要です(ヘアネット、フェイシャルヘアネット、マスク、クリーンルームスーツ、靴カバー)。

1. 選択したCADソフトウェアをインストールし、マイクロ流体チャネルと電極の両方の2次元「マスク」を設計し、設計を目的のファイル形式(.dxf、.dwgなど)で保存します。
   注:2次元マスク回路図の例については、 補足図1 を参照してください。
2. 印刷するサプライヤーに送付します。設計の寸法がサプライヤーの解像度能力の範囲内であることを確認してください。

2. デバイス作製:フォトリソグラフィ

注:提供さ....

結果

図4は、単一パルス振幅に対する単一細胞レベルの膜透過処理検出の背後にある動作原理を示しています。エレクトロポレーション実験の開始後、細胞検出アルゴリズムは、ポイントごとのスロープベースの検出方法を介して、細胞検出に最適な閾値を決定します。次に、システムは、セルの進入を示す測定された電流の有意な負の変化について(1)を継続的に監視します.......

ディスカッション

このプロトコル内で提示される方法論は、主にマイクロ流体デバイスの微細加工に焦点を当てており、その後、特殊なエレクトロポレーション実験セットアップに統合されます。微細加工プロセスの詳細を説明するときによく使用される「レシピ」という用語は、機能するデバイスを正常に製造するために各ステップに従う/最適化することの重要性を示唆しています。ただし、UV露光時間/エ.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
150-mm diameter petri dishes	VWR	25384-326	step 6.1.1 to secure wafer
24-well tissue culture plates	VWR	10062-896	step 10.3.6 to plate electroporated cells
33220A Waveform/Function generator	Agilent		step 9.2.3 electroporation pulse generator
4'' Si-wafers	University Wafer		subsection 2.1 for microfluidic channel fabrication
6-well tissue culture plates	VWR	10062-892	step 8.1.8 to plate cells
Acetone	Fisher Scientific	A18-4	step 2.1.2 for cleaning and  step 5.1 photoresist lift-off
Allegra X-22R Centrifuge	Beckman Coulter		steps 8.1.4 , 8.3.2. and 8.3.3. to spin down cells
AutoCAD 2018	Autodesk		subsection 1.1. to design transparency masks
Buffered oxide etchant 10:1	VWR	901621-1L	subsection 3.1 for HF etching
CCD Monochrome microscope camera	Hamamatsu	Orca 285 C4742-96-12G04	step 11.2.3. for imaging
CMOS camera- Sensicam QE 1.4MP	PCO		subsection 9.3 part of the experimental setup
Conductive Epoxy	CircuitWorks	CW2400	subsection 7.6. for wire attachement
Conical Centrifuge Tubes, 15 mL	Fisher Scientific	14-959-70C	step 8.1.4. for cell centrifuging
Dektak 3ST Surface Profilometer	Veeco (Sloan/Dektak)		step 2.1.15 and 5.4 for surface profilometry
Disposable biopsy punch, 0.75 mm	Robbins Instruments	RBP075	step 6.2.3 for inlet access
Disposable biopsy punch, 3 mm	Robbins Instruments	RBP30P	step 6.2.3 for outlet access
DRAQ5	abcam	ab108410	step 11.2.2. for live cell staining
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium	ThermoFisher Scientific	11885084	step 8.1.2. part of media composition
E3631A Bipolar Triple DC power supply	Agilent		step 9.2.1.-9.2.2.part of the experimental setup
Eclipse TE2000-U Inverted  Microscope	Nikon		subsection 9.3. part of the experimental setup
EVG620 UV Lithography System	EVG		step 2.1.9. and 2.2.7. for UV Exposure
Fetal Bovine Serum	Neuromics	FBS001	step 8.1.2. part of media composition
FS20 Ultrasonic Cleaner	Fisher Scientific		subsection 5.1. for photoresist lift-off
Glass Media Bottle with Cap, 100mL	Fisher Scientific	FB800100	step 8.2.1. for buffer storage
Glass Media Bottle with Cap, 500mL	Fisher Scientific	FB800500	step 8.1.2.for media storage
HEK-293 cell line	ATCC	CRL-1573	subsection 8.1 for cell culturing
HEPES buffer solution	Sigma Aldrich	83264-100ML-F	step 8.2.1 part of electroporation buffer composition
Hexamethyldisilazane	Sigma Aldrich	379212-25ML	step 2.2.3 adhesion promoter
HF2LI Lock-in Amplifier	Zurich Instruments		subsection 9.2 part of the experimental setup
HF2TA Current amplifier	Zurich Instruments		subsection 9.2 part of the experimental setup
Isopropyl Alcohol	Fisher Scientific	A459-1	step 2.1.2 for cleaning, step 2.1.14 for rinsing wafer following SU-8 development, and step 6.3.1 for cleaning PDMS
IX81 fluorescence microscope	Olympus		step 11.2.3 for imaging
L-Glutamine Solution	Sigma Aldrich	G7513-20ML	step 8.1.2. part of media composition
M16878/1BFA 22 gauge wire	AWC	B22-1	subsection 7.5 for device fabrication
Magnesium chloride	Sigma Aldrich	208337-100G	step 8.1.2 part of electroporation buffer composition
MF 319 Developer	Kayaku Advanced Materials	10018042	step 2.2.9. photoresist developer
Microposit S1818 photoresist	Kayaku Advanced Materials	1136925	step 2.2.4 positive photoresist for electrode patterning
Microscope slides, 75 x 25 mm	VWR	16004-422	step 2.2.1 electrode soda lime glass substrate
Model 2350 High voltage amplifier	TEGAM	2350	step 9.2.5. part of the experimental setup
National Instruments LabVIEW	National Instruments		data acquisition
Needle, 30G x 1 in	BD Scientific	305128	step 10.1.1. part of the system priming
PA90 IC OPAMP Power circuit	Digi-key	598-1330-ND	Part of the custom circuit
Penicillin-Streptomycin	Sigma Aldrich	P4458-20ML	step 8.1.2. part of media composition
Plasmid pMAX-GFP	Lonza	VCA-1003	step 8.3.4. for intracellular delivery
Plastic tubing, 0.010'' x 0.030"	VWR	89404-300	step 10.1.2. for system priming
Platinum targets	Kurt J. Lesker		subsection 4.2. for physical vapor deposition
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P9333-500G	step 8.2.1. part of electroporation buffer composition
Pump 11 PicoPlus microfluidic syringe pump	Harvard Apparatus	MA1 70-2213	step 10.1.4. for system priming
PVD75 Physical vapor deposition system	Kurt J. Lesker		subsection 4.1. for physical vapor deposition
PWM32 Spinner System	Headway Research		steps 2.1.6 and 2.2.2. for substrate coating with photoresist
PX-250 Plasma treatment system	March Instruments		subsection 7.2 for PDMS and glass substrate bonding
SDG1025 Function/Waveform generator	Siglent		step 9.2.2. part of the experimental setup
Sodium hydroxide	Sigma Aldrich	S8045-500G	step 8.2.1. part of electroporation buffer composition
SU-8 2010 negative photoresist	Kayaku Advanced Materials	Y111053	step 2.1.7. for microfluidic channel patterning
SU-8 developer	Microchem	Y010200	step 2.1.12. for photoresist developing
Sucrose	Sigma Aldrich	S7903-1KG	step 8.2.1. part of electroporation buffer composition
Sylgard 184 elastomer kit	Dow Corning	3097358-1004	step 6.2.1  10 : 1 mixture of PDMS polymer and hardening agent
Syringe, 1 ml	BD Scientific	309628	step 8.3.4. part of system priming
SZ61 Stereomicroscope System	Olympus		subsection 7.3. for channel and electrode alignment
Tissue Culture Treated T25 Flasks	Falcon	353108	step 8.1.2 for cell culturing
Titanium targets	Kurt J. Lesker		subsection 4.2. for physical vapor deposition
Transparency masks	CAD/ART Services		steps 2.1.9. and 2.2.7. for photolithography
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane	Sigma Aldrich	448931-10G	step 6.1.2. for wafer silanization
Trypsin-EDTA solution	Sigma Aldrich	T4049-100ML	steps 8.1.3. and 8.3.1. for cell harvesting