JoVE Logo
Faculty Resource Center
Authors
Librarians
High Schools
About

Sign In

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Acknowledgements

Materials

References

Biology

Het voorbereiden en fokken van axeeninsecten met weefsel gekweekte zaailingen voor gastheer-darmmicrobiota-interactiestudies van de bladkever

Published: October 8th, 2021

DOI:

10.3791/63195

1State Key Laboratory of Biocatalysis and Enzyme Engineering, School of Life Sciences, Hubei University, 2Institute of Plant Protection, Wuhan Institute of Landscape Architecture, 3McKetta Department of Chemical Engineering, University of Texas at Austin

Om een axeeninsect te verkrijgen, wordt het eioppervlak gesteriliseerd en wordt de uitgekomen larve vervolgens grootgebracht met behulp van axeenbladeren. Deze methode biedt een efficiënte manier voor axeeninsectenbereiding zonder antibiotica toe te dienen of een kunstmatig dieet te ontwikkelen, dat ook kan worden toegepast op andere bladetende insecten.

Insectendarmen worden gekoloniseerd door diverse bacteriën die de fysiologische eigenschappen van de gastheer diepgaand kunnen beïnvloeden. Het introduceren van een bepaalde bacteriestam in een axeeninsect is een krachtige methode om de microbiële darmfunctie te verifiëren en de mechanismen op te helderen die ten grondslag liggen aan interacties tussen darmmicroben en gastheer. Het toedienen van antibiotica of het steriliseren van eioppervlakken zijn twee veelgebruikte methoden om darmbacteriën van insecten te verwijderen. Naast de mogelijke nadelige effecten van antibiotica op insecten, gaven eerdere studies echter aan dat het voeren van antibiotica darmbacteriën niet kon elimineren. Kiemvrije kunstmatige diëten worden dus over het algemeen gebruikt om axeeninsecten te behouden, wat een vervelend en arbeidsintensief proces is dat niet volledig kan lijken op voedingscomponenten in natuurlijk voedsel. Hier wordt een efficiënt en eenvoudig protocol beschreven om axeenlarven van een bladkever (Plagiodera versicolora) te bereiden en te onderhouden. In het bijzonder werden oppervlakken van de kevereieren gesteriliseerd, waarna kiemvrije populierenbladeren werden gebruikt om axeenlarven op te voeden. De axeenstatus van de insecten werd verder bevestigd door middel van cultuurafhankelijke en cultuuronafhankelijke testen. Gezamenlijk, door het combineren van eierdesinfectie en kiemvrije teelt, werd een efficiënte en handige methode ontwikkeld om axeen P. versicolora te verkrijgen, een gemakkelijk overdraagbaar hulpmiddel voor andere bladetende insecten.

Net als bij zoogdieren is het spijsverteringskanaal van insecten een holte voor voedselvertering en -absorptie. De meeste insecten herbergen diverse commensale bacteriën die gedijen in hun darmen en leven van voeding geleverd door gastheren1. De darmcommensale gemeenschap heeft een diepgaande invloed op meerdere fysiologische processen bij insecten, waaronder voedselvertering en ontgifting 2,3,4, voeding en ontwikkeling 5,6,7, verdediging tegen pathogenen en p....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Insectenopfok

  1. Houd de P. versicolora populatie in een groeikamer op de conditie van 27 °C en 70 ± 5% relatieve vochtigheid met een fotoperiode van 16 h licht/8 h donker. Leg ze in geperforeerde plastic dozen met betegeld nat absorberend papier en voer ze verse populierentakken. Spuit schoon water op absorberend papier om vocht vast te houden en ververs de takken om de twee dagen.
  2. Isoleer volwassenen voor ovipositie na verpopping. Voer ze zachte bladeren om meer eieren te.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De levensfasen van P. versicolora zijn weergegeven in figuur 1. Het volwassen mannetje is kleiner dan het volwassen vrouwtje (figuur 1A). In het veld clustert de kever zijn eieren op een blad; hier werden vier eieren losgemaakt van een blad (figuur 1B). De populierenstengelsegmenten en zaailingen die worden gebruikt voor het fokken van axeeninsecten zijn weergegeven in figuur 2. De darm van een.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bereiding van kiemvrije larven en het verkrijgen van gnotobiotische larven door specifieke bacteriestammen opnieuw te introduceren, zijn krachtige methoden om de mechanismen die ten grondslag liggen aan gastheer-microbe-interacties op te helderen. Pas uitgekomen larven verkrijgen darmmicrobiota op twee belangrijke manieren: verticale overdracht van de moeder naar het nageslacht of horizontale acquisitie van broers en zussen en de omgeving34. De eerste kan worden vervuld door ouderlijke overdracht .......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dit werk werd gefinancierd door de National Natural Science Foundation of China (31971663) en het Young Elite Scientists Sponsorship Program door CAST (2020QNRC001).

....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 µm syringe filtersMilliporeSLGP033RB
1 mg/mL NAA stock solutiona. Prepare 0.1 M NaOH solution (dissolve 0.8 g NaOH in 200 mL of distilled water).
b. Add 0.2 g NAA in a 250 mL beaker, add little 0.1 M NaOH solution until NAA dissolved, and adjust the final volume to 200 mL with distilled water.
c. Filter the solution to remove bacteria with a 0.22 µm syringe filter and a 50 mL sterile syringe, subpackage the solution in 1.5 mL centrifuge tubes and restore at -20 °C.
1.5 mL microcentrifuge tubesSangon BiotechF600620
10x PBS stock solutionBiosharp Life SciencesBL302A
2 M KOH solutionDissolve 22.44 g KOH (molecular weight: 56.1) in 200 mL of distilled water and autoclave it for 20 min at 121 °C.
250 mL and 2,000 mL beakersShubosb16455
50 mL sterile syringesJintaJT0125789
500 mL measuring cylinderShubosb1601
50x TAE stock solutiona. Dissolve 242 g Tris and 18.612 g EDTA in 700 mL of distilled water.
b. Adjust pH to 7.8 with about 57.1 mL of acetic acid.
c. Adjust the final volume to 1,000 mL.
d. The stock solution was diluted to 1x TAE buffer when used.
75% ethanolXingheda trade
α-naphthalene acetic acid (NAA)Solarbio Life Sciences86-87-3
Absorbing paper22.3 cm x 15.3 cm x 9 cm
Acetic acidSinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
AgarCoolaber9002-18-0
AgaroseBiowest111860
AutoclavePanasonicMLS-3781L-PC
Bead-beating homogenizerJing XinXM-GTL64
DNA extraction kitMP Biomedicals116560200
EDTASaiguo Biotech1340
Filter paperJiaojie70 mm diameter
Gel electrophoresis unitBio-rad164-5052
Gel Signal Green nucleic acid dyeTsingKeTSJ003
Germ-free poplar seedlingsShan Xin poplar from Ludong University in Shandong Province
Golden Star Super PCR Master Mix (1.1×)TsingKeTSE101
Growth chamberRuihuaHP400GS-C
LB agar mediuma. Dissolve 5 g tryptone, 5 g NaCl, 2.5 g yeast extract in 300 mL of distilled water.
b. Adjust the final volume to 500 mL, transfer the solution to a 1,000 mL conical flask, and add 7.5 g agar.
c. Autoclave the medium for 20 min at 121 °C.
Mini centrifugeDRAGONLABD1008
MS basic mediumCoolaberPM1121-50LM0245
MS solid medium for germ-free poplar seedling culturea. Dissolve 4.43 g MS basic medium powder and 30 g sucrose in 800 mL of distilled water.
b. Adjust the pH to about 5.8 with 2 M KOH by a pH meter.
c. Adjust the final volume to 1,000 mL, separate into two parts, transfer into two 1,000 mL conical flasks, and add 2.6 g agar per 500 mL.
d. Autoclave for 20 min at 121 °C.
NanoDrop 1000 spectrophotometerThermo Fisher Scientific
Paintbrush1 cm width, used to collect the eggs
ParafilmBemisPM-996
PCR Thermal CyclersEppendorf6331000076
Petri dishesSupin90 mm diameter
pH meterMETTLER TOLEDOFE20
Pipettes 0.2-2 µLGilsonECS000699
Pipettes 100-1,000 µLEppendorf3120000267
Pipettes 20-200 µLEppendorf3120000259
Pipettes 2-20 µLEppendorf3120000232
Plant tissue culture containerChembaseZP21240 mL
Plastic box2.35 L
Potassium hydroxide (KOH)Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
Primers for amplifying the bacterial 16S rRNA geneSangon Biotech27-F: 5’-ACGGATACCTTGTTACGAC-3’, 1492R: 5’-ACGGATACCTTGTTACGAC-3’
Sodium chloride (NaCl)Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
Sodium hydroxide (NaOH)Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
Steel balls0.25 mmused to grind tissues
StereomicroscopeOLYMPUSSZ61
SucroseSinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
Trans2K plus II DNA markerTransgene BiotechBM121-01
Tris baseBiosharp Life Sciences1115
TryptoneThermo Fisher Scientific LP0037
UV transilluminatorMonad BiotechQuickGel 6100
VortexerScilogexMX-S
Willow branchesSha Lake Park, Wuhan, China
Willow leaf beetleHuazhong Agricultural University, Wuhan, China
Yeast extractThermo Fisher ScientificLP0021

  1. Moran, N. A., Ochman, H., Hammer, T. J. Evolutionary and ecological consequences of gut microbial communities. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 50 (1), 451-475 (2019).
  2. Warnecke, F., et al. Metagenomic and functional analysis of hindgut microbiota of a wood-feeding higher termite. Nature. 450 (7169), 560-565 (2007).
  3. Tokuda, G., et al. Fiber-associated spirochetes are major agents of hemicellulose degradation in the hindgut of wood-feeding higher termites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (51), 11996-12004 (2018).
  4. Wang, G. H., et al. Changes in microbiome confer multigenerational host resistance after sub-toxic pesticide exposure. Cell Host & Microbe. 27 (2), 213-224 (2020).
  5. Shin, S. C., et al. Drosophila microbiome modulates host developmental and metabolic homeostasis via insulin signaling. Science. 334 (6056), 670-674 (2011).
  6. Storelli, G., et al. Lactobacillus plantarum promotes Drosophila systemic growth by modulating hormonal signals through TOR-dependent nutrient sensing. Cell Metabolism. 14 (3), 403-414 (2011).
  7. Salem, H., et al. Vitamin supplementation by gut symbionts ensures metabolic homeostasis in an insect host. Proceedings. Biological Sciences. 281 (1796), 20141838 (2014).
  8. Koch, H., Schmid-Hempel, P. Socially transmitted gut microbiota protect bumble bees against an intestinal parasite. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19288-19292 (2011).
  9. Cirimotich, C. M., et al. Natural microbe-mediated refractoriness to Plasmodium infection in Anopheles gambiae. Science. 332 (6031), 855-858 (2011).
  10. Kaltenpoth, M., Gottler, W., Herzner, G., Strohm, E. Symbiotic bacteria protect wasp larvae from fungal infestation. Current Biology. 15 (5), 475-479 (2005).
  11. Yuan, C., Xing, L., Wang, M., Hu, Z., Zou, Z. Microbiota modulates gut immunity and promotes baculovirus infection in Helicoverpa armigera. Insect Science. , (2021).
  12. Dillon, R. J., Vennard, C. T., Charnley, A. K. Pheromones - Exploitation of gut bacteria in the locust. Nature. 403 (6772), 851 (2000).
  13. Xu, L. T., Lou, Q. Z., Cheng, C. H., Lu, M., Sun, J. H. Gut-associated bacteria of Dendroctonus valens and their involvement in verbenone production. Microbial Ecology. 70 (4), 1012-1023 (2015).
  14. Schretter, C. E., et al. A gut microbial factor modulates locomotor behaviour in Drosophila. Nature. 563 (7731), 402-406 (2018).
  15. Jia, Y., et al. Gut microbiome modulates Drosophila aggression through octopamine signaling. Nature Communications. 12 (1), 2698 (2021).
  16. Ma, M., et al. Metabolic and immunological effects of gut microbiota in leaf beetles at the local and systemic levels. Integrative Zoology. 16 (3), 313-323 (2021).
  17. Xu, L., et al. Synergistic action of the gut microbiota in environmental RNA interference in a leaf beetle. Microbiome. 9 (1), 98 (2021).
  18. Xu, L., et al. Gut microbiota in an invasive bark beetle infected by a pathogenic fungus accelerates beetle mortality. Journal of Pest Science. 92, 343-351 (2019).
  19. Berasategui, A., Shukla, S., Salem, H., Kaltenpoth, M. Potential applications of insect symbionts in biotechnology. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (4), 1567-1577 (2016).
  20. Tikhe, C. V., Martin, T. M., Howells, A., Delatte, J., Husseneder, C. Assessment of genetically engineered Trabulsiella odontotermitis as a 'Trojan Horse' for paratransgenesis in termites. BMC Microbiology. 16 (1), 202 (2016).
  21. Wang, S., et al. Fighting malaria with engineered symbiotic bacteria from vector mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (31), 12734-12739 (2012).
  22. Leonard, S. P., et al. Engineered symbionts activate honey bee immunity and limit pathogens. Science. 367 (6477), 573-576 (2020).
  23. Kietz, C., Pollari, V., Meinander, A. Generating germ-free Drosophila to study gut-microbe interactions: protocol to rear Drosophila under axenic conditions. Current Protocols in Toxicology. 77 (1), 52 (2018).
  24. Brummel, T., Ching, A., Seroude, L., Simon, A. F., Benzer, S. Drosophila lifespan enhancement by exogenous bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12974-12979 (2004).
  25. Correa, M. A., Matusovsky, B., Brackney, D. E., Steven, B. Generation of axenic Aedes aegypti demonstrate live bacteria are not required for mosquito development. Nature Communications. 9 (1), 4464 (2018).
  26. Romoli, O., Schonbeck, J. C., Hapfelmeier, S., Gendrin, M. Production of germ-free mosquitoes via transient colonisation allows stage-specific investigation of host-microbiota interactions. Nature Communications. 12 (1), 942 (2021).
  27. Berasategui, A., et al. Gut microbiota of the pine weevil degrades conifer diterpenes and increases insect fitness. Molecular Ecology. 26 (15), 4099-4110 (2017).
  28. Lin, X. L., Kang, Z. W., Pan, Q. J., Liu, T. X. Evaluation of five antibiotics on larval gut bacterial diversity of Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae). Insect Science. 22 (5), 619-628 (2015).
  29. Muhammad, A., Habineza, P., Hou, Y., Shi, Z. Preparation of red palm weevil Rhynchophorus Ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Dryophthoridae) germ-free larvae for host-gut microbes interaction studies. Bio-protocol. 9 (24), 3456 (2019).
  30. Gelman, D. B., Bell, R. A., Liska, L. J., Hu, J. S. Artificial diets for rearing the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata. Journal of Insect Science. 1, 7 (2001).
  31. Bengtson, D. A. A comprehensive program for the evaluation of artificial diets. Journal of the World Aquaculture Society. 24 (2), 285-293 (2007).
  32. Utsumi, S., Ando, Y., Ohgushi, T. Evolution of feeding preference in a leaf beetle: the importance of phenotypic plasticity of a host plant. Ecology Letters. 12 (9), 920-929 (2009).
  33. Ishihara, M., Ohgushi, T. Reproductive inactivity and prolonged developmental time induced by seasonal decline in host plant quality in the willow leaf beetle Plagiodera versicolora (Coleoptera: Chrysomelidae). Environmental Entomology. 35 (2), 524-530 (2006).
  34. Bright, M., Bulgheresi, S. A complex journey: transmission of microbial symbionts. Nature Reviews: Microbiology. 8 (3), 218-230 (2010).
  35. Hassan, B., Siddiqui, J. A., Xu, Y. Vertically transmitted gut bacteria and nutrition influence the immunity and fitness of Bactrocera dorsalis larvae. Frontiers in Microbiology. 11, 596352 (2020).
  36. Hosokawa, T., et al. Obligate bacterial mutualists evolving from environmental bacteria in natural insect populations. Nature Microbiology. 1, 15011 (2016).
  37. Habineza, P., et al. The promoting effect of gut microbiota on growth and development of red palm weevil, Rhynchophorus ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Dryophthoridae) by modulating its nutritional metabolism. Frontiers in Microbiology. 10, 1212 (2019).
  38. Meilan, R., Ma, C. Poplar (Populus spp.). Methods in Molecular Biology. 344, 143-151 (2006).
  39. Wani, Z. A., Ashraf, N., Mohiuddin, T., Riyaz-Ul-Hassan, S. Plant-endophyte symbiosis, an ecological perspective. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (7), 2955-2965 (2015).
  40. Grout, B. W. Meristem-tip culture. Methods in Molecular Biology. 6, 81-91 (1990).

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved