הכנה וגידול של חרקים אקסניים עם שתילים מתרבית רקמה למחקרי אינטראקציה של מיקרוביוטה של המעי המארח של חיפושית העלים

Published: October 8th, 2021

DOI:

10.3791/63195

Meiqi Ma¹, Pei Liu¹, Jingya Yu², Runhua Han³, Letian Xu¹

¹State Key Laboratory of Biocatalysis and Enzyme Engineering, School of Life Sciences, Hubei University, ²Institute of Plant Protection, Wuhan Institute of Landscape Architecture, ³McKetta Department of Chemical Engineering, University of Texas at Austin

כדי להשיג חרק אקסני, משטח הביצה שלו מעוקר, והזחל הבוקע גדל לאחר מכן באמצעות עלים אקסניים. שיטה זו מספקת דרך יעילה להכנת חרקים אקסניים מבלי לתת אנטיביוטיקה או לפתח תזונה מלאכותית, אשר ניתן ליישם גם על חרקים אוכלי עלים אחרים.

מעיים של חרקים מיושבים על ידי חיידקים מגוונים שיכולים להשפיע באופן עמוק על התכונות הפיזיולוגיות של הפונדקאי. החדרת זן חיידקי מסוים לחרק אקסני היא שיטה רבת עוצמה לאימות תפקוד המיקרוביאלי של המעיים ולהבהרת המנגנונים העומדים בבסיס האינטראקציות בין חיידקי המעיים לפונדקאי. מתן אנטיביוטיקה או עיקור משטחי ביצים הן שתי שיטות נפוצות להסרת חיידקי מעיים מחרקים. עם זאת, בנוסף להשפעות השליליות הפוטנציאליות של אנטיביוטיקה על חרקים, מחקרים קודמים הצביעו על כך שהאכלת אנטיביוטיקה לא יכולה לחסל את חיידקי המעיים. לפיכך, דיאטות מלאכותיות ללא חיידקים משמשות בדרך כלל לשמירה על חרקים אקסניים, שהוא תהליך מייגע ועתיר עבודה שאינו יכול להידמות באופן מלא למרכיבים תזונתיים במזון טבעי. מתואר כאן פרוטוקול יעיל ופשוט להכנה ותחזוקה של זחלים אקסניים של חיפושית עלים (Plagiodera versicolora). באופן ספציפי, משטחים של ביצי החיפושית עוקרו, ולאחר מכן עלי צפצפה נטולי חיידקים שימשו לגידול זחלים אקסניים. מעמדם האקסני של החרקים אושש עוד יותר באמצעות מבחנים תלויי תרבות ובלתי תלויי תרבות. באופן קולקטיבי, על ידי שילוב של חיטוי ביצים וטיפוח ללא חיידקים, פותחה שיטה יעילה ונוחה להשגת P. versicolora אקסני, המספקת כלי הניתן להעברה בקלות לחרקים אוכלי עלים אחרים.

בדומה ליונקים, מערכת העיכול של החרקים היא חלל לעיכול המזון ולספיגתו. רוב החרקים מכילים חיידקים קומנסליים מגוונים שמשגשגים במעיים שלהם וחיים על תזונה המסופקת על ידי פונדקאים¹. לקהילת המעיים יש השפעה עמוקה על תהליכים פיזיולוגיים מרובים בחרקים, כולל עיכול מזון וניקוי רעלים ^2,3,4, תזונה והתפתחות ^5,6,7, הגנה מפני פתוגנים וטפילים 8,9,10,11, תקשורת כימית

1. גידול חרקים

שמור על אוכלוסיית P. versicolora בתא גידול במצב של 27 ° C ו 70 ± 5% לחות יחסית עם photoperiod של 16 שעות בהיר / 8 שעות כהה. מניחים אותם בקופסאות פלסטיק מחוררות עם נייר סופג רטוב מרוצף אריחים ומזינים אותם בענפי צפצפה טריים. מרססים מים נקיים על נייר סופג כדי לשמור על הלחות ולהחלי.......

שלבי החיים של P. versicolora מוצגים באיור 1. הזכר הבוגר קטן יותר מהנקבה הבוגרת (איור 1A). בשדה, החיפושית מקבצת את ביציה על עלה; כאן, ארבע ביצים נותקו מעלה (איור 1B). מקטעי גזע הצפצפה והשתילים המשמשים לגידול חרקים אקסניים מוצגים באיור 2

הכנת זחלים נטולי חיידקים והשגת זחלים גנוטוביוטים על ידי הכנסה מחדש של זני חיידקים ספציפיים הן שיטות רבות עוצמה להבהרת המנגנונים העומדים בבסיס האינטראקציות בין פונדקאי למיקרובים. זחלים שזה עתה בקעו משיגים מיקרוביוטה של המעיים בשתי דרכים עיקריות: העברה אנכית מהאם לצאצאים או רכישה אופקית ?.......

עבודה זו מומנה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (31971663) ותוכנית החסות למדעני עילית צעירים על ידי CAST (2020QNRC001).

....

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm syringe filters	Millipore	SLGP033RB
1 mg/mL NAA stock solution			a. Prepare 0.1 M NaOH solution (dissolve 0.8 g NaOH in 200 mL of distilled water). b. Add 0.2 g NAA in a 250 mL beaker, add little 0.1 M NaOH solution until NAA dissolved, and adjust the final volume to 200 mL with distilled water. c. Filter the solution to remove bacteria with a 0.22 µm syringe filter and a 50 mL sterile syringe, subpackage the solution in 1.5 mL centrifuge tubes and restore at -20 °C.
1.5 mL microcentrifuge tubes	Sangon Biotech	F600620
10x PBS stock solution	Biosharp Life Sciences	BL302A
2 M KOH solution			Dissolve 22.44 g KOH (molecular weight: 56.1) in 200 mL of distilled water and autoclave it for 20 min at 121 °C.
250 mL and 2,000 mL beakers	Shubo	sb16455
50 mL sterile syringes	Jinta	JT0125789
500 mL measuring cylinder	Shubo	sb1601
50x TAE stock solution			a. Dissolve 242 g Tris and 18.612 g EDTA in 700 mL of distilled water. b. Adjust pH to 7.8 with about 57.1 mL of acetic acid. c. Adjust the final volume to 1,000 mL. d. The stock solution was diluted to 1x TAE buffer when used.
75% ethanol	Xingheda trade
α-naphthalene acetic acid (NAA)	Solarbio Life Sciences	86-87-3
Absorbing paper			22.3 cm x 15.3 cm x 9 cm
Acetic acid	Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
Agar	Coolaber	9002-18-0
Agarose	Biowest	111860
Autoclave	Panasonic	MLS-3781L-PC
Bead-beating homogenizer	Jing Xin	XM-GTL64
DNA extraction kit	MP Biomedicals	116560200
EDTA	Saiguo Biotech	1340
Filter paper	Jiaojie		70 mm diameter
Gel electrophoresis unit	Bio-rad	164-5052
Gel Signal Green nucleic acid dye	TsingKe	TSJ003
Germ-free poplar seedlings			Shan Xin poplar from Ludong University in Shandong Province
Golden Star Super PCR Master Mix (1.1×)	TsingKe	TSE101
Growth chamber	Ruihua	HP400GS-C
LB agar medium			a. Dissolve 5 g tryptone, 5 g NaCl, 2.5 g yeast extract in 300 mL of distilled water. b. Adjust the final volume to 500 mL, transfer the solution to a 1,000 mL conical flask, and add 7.5 g agar. c. Autoclave the medium for 20 min at 121 °C.
Mini centrifuge	DRAGONLAB	D1008
MS basic medium	Coolaber	PM1121-50L	M0245
MS solid medium for germ-free poplar seedling culture			a. Dissolve 4.43 g MS basic medium powder and 30 g sucrose in 800 mL of distilled water. b. Adjust the pH to about 5.8 with 2 M KOH by a pH meter. c. Adjust the final volume to 1,000 mL, separate into two parts, transfer into two 1,000 mL conical flasks, and add 2.6 g agar per 500 mL. d. Autoclave for 20 min at 121 °C.
NanoDrop 1000 spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific
Paintbrush			1 cm width, used to collect the eggs
Parafilm	Bemis	PM-996
PCR Thermal Cyclers	Eppendorf	6331000076
Petri dishes	Supin		90 mm diameter
pH meter	METTLER TOLEDO	FE20
Pipettes 0.2-2 µL	Gilson	ECS000699
Pipettes 100-1,000 µL	Eppendorf	3120000267
Pipettes 20-200 µL	Eppendorf	3120000259
Pipettes 2-20 µL	Eppendorf	3120000232
Plant tissue culture container	Chembase	ZP21	240 mL
Plastic box			2.35 L
Potassium hydroxide (KOH)	Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
Primers for amplifying the bacterial 16S rRNA gene	Sangon Biotech		27-F: 5’-ACGGATACCTTGTTACGAC-3’, 1492R: 5’-ACGGATACCTTGTTACGAC-3’
Sodium chloride (NaCl)	Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
Sodium hydroxide (NaOH)	Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
Steel balls		0.25 mm	used to grind tissues
Stereomicroscope	OLYMPUS	SZ61
Sucrose	Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
Trans2K plus II DNA marker	Transgene Biotech	BM121-01
Tris base	Biosharp Life Sciences	1115
Tryptone	Thermo Fisher Scientific	LP0037
UV transilluminator	Monad Biotech	QuickGel 6100
Vortexer	Scilogex	MX-S
Willow branches			Sha Lake Park, Wuhan, China
Willow leaf beetle			Huazhong Agricultural University, Wuhan, China
Yeast extract	Thermo Fisher Scientific	LP0021

Moran, N. A., Ochman, H., Hammer, T. J. Evolutionary and ecological consequences of gut microbial communities. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 50 (1), 451-475 (2019).
Warnecke, F., et al. Metagenomic and functional analysis of hindgut microbiota of a wood-feeding higher termite. Nature. 450 (7169), 560-565 (2007).
Tokuda, G., et al. Fiber-associated spirochetes are major agents of hemicellulose degradation in the hindgut of wood-feeding higher termites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (51), 11996-12004 (2018).
Wang, G. H., et al. Changes in microbiome confer multigenerational host resistance after sub-toxic pesticide exposure. Cell Host & Microbe. 27 (2), 213-224 (2020).
Shin, S. C., et al. Drosophila microbiome modulates host developmental and metabolic homeostasis via insulin signaling. Science. 334 (6056), 670-674 (2011).
Storelli, G., et al. Lactobacillus plantarum promotes Drosophila systemic growth by modulating hormonal signals through TOR-dependent nutrient sensing. Cell Metabolism. 14 (3), 403-414 (2011).
Salem, H., et al. Vitamin supplementation by gut symbionts ensures metabolic homeostasis in an insect host. Proceedings. Biological Sciences. 281 (1796), 20141838 (2014).
Koch, H., Schmid-Hempel, P. Socially transmitted gut microbiota protect bumble bees against an intestinal parasite. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19288-19292 (2011).
Cirimotich, C. M., et al. Natural microbe-mediated refractoriness to Plasmodium infection in Anopheles gambiae. Science. 332 (6031), 855-858 (2011).
Kaltenpoth, M., Gottler, W., Herzner, G., Strohm, E. Symbiotic bacteria protect wasp larvae from fungal infestation. Current Biology. 15 (5), 475-479 (2005).
Yuan, C., Xing, L., Wang, M., Hu, Z., Zou, Z. Microbiota modulates gut immunity and promotes baculovirus infection in Helicoverpa armigera. Insect Science. , (2021).
Dillon, R. J., Vennard, C. T., Charnley, A. K. Pheromones - Exploitation of gut bacteria in the locust. Nature. 403 (6772), 851 (2000).
Xu, L. T., Lou, Q. Z., Cheng, C. H., Lu, M., Sun, J. H. Gut-associated bacteria of Dendroctonus valens and their involvement in verbenone production. Microbial Ecology. 70 (4), 1012-1023 (2015).
Schretter, C. E., et al. A gut microbial factor modulates locomotor behaviour in Drosophila. Nature. 563 (7731), 402-406 (2018).
Jia, Y., et al. Gut microbiome modulates Drosophila aggression through octopamine signaling. Nature Communications. 12 (1), 2698 (2021).
Ma, M., et al. Metabolic and immunological effects of gut microbiota in leaf beetles at the local and systemic levels. Integrative Zoology. 16 (3), 313-323 (2021).
Xu, L., et al. Synergistic action of the gut microbiota in environmental RNA interference in a leaf beetle. Microbiome. 9 (1), 98 (2021).
Xu, L., et al. Gut microbiota in an invasive bark beetle infected by a pathogenic fungus accelerates beetle mortality. Journal of Pest Science. 92, 343-351 (2019).
Berasategui, A., Shukla, S., Salem, H., Kaltenpoth, M. Potential applications of insect symbionts in biotechnology. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (4), 1567-1577 (2016).
Tikhe, C. V., Martin, T. M., Howells, A., Delatte, J., Husseneder, C. Assessment of genetically engineered Trabulsiella odontotermitis as a 'Trojan Horse' for paratransgenesis in termites. BMC Microbiology. 16 (1), 202 (2016).
Wang, S., et al. Fighting malaria with engineered symbiotic bacteria from vector mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (31), 12734-12739 (2012).
Leonard, S. P., et al. Engineered symbionts activate honey bee immunity and limit pathogens. Science. 367 (6477), 573-576 (2020).
Kietz, C., Pollari, V., Meinander, A. Generating germ-free Drosophila to study gut-microbe interactions: protocol to rear Drosophila under axenic conditions. Current Protocols in Toxicology. 77 (1), 52 (2018).
Brummel, T., Ching, A., Seroude, L., Simon, A. F., Benzer, S. Drosophila lifespan enhancement by exogenous bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12974-12979 (2004).
Correa, M. A., Matusovsky, B., Brackney, D. E., Steven, B. Generation of axenic Aedes aegypti demonstrate live bacteria are not required for mosquito development. Nature Communications. 9 (1), 4464 (2018).
Romoli, O., Schonbeck, J. C., Hapfelmeier, S., Gendrin, M. Production of germ-free mosquitoes via transient colonisation allows stage-specific investigation of host-microbiota interactions. Nature Communications. 12 (1), 942 (2021).
Berasategui, A., et al. Gut microbiota of the pine weevil degrades conifer diterpenes and increases insect fitness. Molecular Ecology. 26 (15), 4099-4110 (2017).
Lin, X. L., Kang, Z. W., Pan, Q. J., Liu, T. X. Evaluation of five antibiotics on larval gut bacterial diversity of Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae). Insect Science. 22 (5), 619-628 (2015).
Muhammad, A., Habineza, P., Hou, Y., Shi, Z. Preparation of red palm weevil Rhynchophorus Ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Dryophthoridae) germ-free larvae for host-gut microbes interaction studies. Bio-protocol. 9 (24), 3456 (2019).
Gelman, D. B., Bell, R. A., Liska, L. J., Hu, J. S. Artificial diets for rearing the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata. Journal of Insect Science. 1, 7 (2001).
Bengtson, D. A. A comprehensive program for the evaluation of artificial diets. Journal of the World Aquaculture Society. 24 (2), 285-293 (2007).
Utsumi, S., Ando, Y., Ohgushi, T. Evolution of feeding preference in a leaf beetle: the importance of phenotypic plasticity of a host plant. Ecology Letters. 12 (9), 920-929 (2009).
Ishihara, M., Ohgushi, T. Reproductive inactivity and prolonged developmental time induced by seasonal decline in host plant quality in the willow leaf beetle Plagiodera versicolora (Coleoptera: Chrysomelidae). Environmental Entomology. 35 (2), 524-530 (2006).
Bright, M., Bulgheresi, S. A complex journey: transmission of microbial symbionts. Nature Reviews: Microbiology. 8 (3), 218-230 (2010).
Hassan, B., Siddiqui, J. A., Xu, Y. Vertically transmitted gut bacteria and nutrition influence the immunity and fitness of Bactrocera dorsalis larvae. Frontiers in Microbiology. 11, 596352 (2020).
Hosokawa, T., et al. Obligate bacterial mutualists evolving from environmental bacteria in natural insect populations. Nature Microbiology. 1, 15011 (2016).
Habineza, P., et al. The promoting effect of gut microbiota on growth and development of red palm weevil, Rhynchophorus ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Dryophthoridae) by modulating its nutritional metabolism. Frontiers in Microbiology. 10, 1212 (2019).
Meilan, R., Ma, C. Poplar (Populus spp.). Methods in Molecular Biology. 344, 143-151 (2006).
Wani, Z. A., Ashraf, N., Mohiuddin, T., Riyaz-Ul-Hassan, S. Plant-endophyte symbiosis, an ecological perspective. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (7), 2955-2965 (2015).
Grout, B. W. Meristem-tip culture. Methods in Molecular Biology. 6, 81-91 (1990).

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: