Um sistema microfisiológico para estudar a interação das células leucócitos-endoteliais durante a inflamação

Resumo

Neste protocolo, um ensaio biomimético de microfluido, que pode reproduzir um ambiente microvascular fisiologicamente relevante e reproduzir toda a cascata de adesão/migração leucócito, é empregado para estudar interações células leucócitos-endoteliais em doenças inflamatórias.

Resumo

As interações leucócito-endotelial desempenham um papel importante em doenças inflamatórias, como a sepse. Durante a inflamação, a migração excessiva de leucócitos ativados através do endotélio vascular em órgãos-chave pode levar à falência de órgãos. Um ensaio microfluido biomimético fisiologicamente relevante (bMFA) foi desenvolvido e validado utilizando várias técnicas experimentais e computacionais, que podem reproduzir toda a cascata de rolagem/adesão/migração leucócitos para estudar interações células leucócitos-endoteliais. Redes microvasculares obtidas a partir de imagens in vivo em roedores foram digitalizadas usando uma abordagem do Sistema de Informações Geográficas (SIG) e microfabricadas com polidimtilsiloxano (PDMS) em um slide de microscópio. Para estudar o efeito da taxa de corte e topologia vascular nas interações leucócito-endotelial, foi desenvolvido um modelo de Dinâmica de Fluidos Computacionais (CFD) para gerar um mapa correspondente de taxas de corte e velocidades em toda a rede. O bMFA permite a quantificação de interações leucócito-endotelial, incluindo velocidade de rolamento, número de leucócitos aderidos em resposta a diferentes taxas de tesoura, número de leucócitos migrados, permeabilidade de células endoteliais, expressão de molécula de adesão e outras variáveis importantes. Além disso, utilizando amostras relacionadas ao homem, como células endoteliais humanas e leucócitos, a BMFA fornece uma ferramenta para uma triagem rápida de potenciais terapêuticas para aumentar sua tradução clínica.

Introdução

A inflamação é a resposta do hospedeiro à infecção e lesão, e o endotélio desempenha um papel importante na resposta inflamatória ^1,2,3. A desregulação inflamatória é a causa básica de uma série de patologias da doença, como sepse, doenças cardiovasculares, asma, doença inflamatória intestinal, câncer e COVID-19. As interações leucócito-endotelial desempenham um papel central nessas doenças inflamatórias. Durante a inflamação, a liberação de PAMPS (padrões moleculares associados ao patógeno) de patógenos ou DAMPS (padrões moleculares associados a danos) de tecidos feridos ati....

Protocolo

O sangue humano heparinizado é obtido para isolamento de neutrófilos de doadores adultos saudáveis (homens e mulheres, com idade entre 21 e 60 anos), seguindo o consentimento informado, conforme aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional da Temple University (Filadélfia, PA, EUA).

1. Priming e revestimento do dispositivo com fibronectina humana

NOTA: O bMFA possui duas portas de entrada e duas portas de saída conectadas ao compartimento vascular. Também possui uma porta conectada ao compartimento tecidual (Figura 2).

1. Inserir tubos (O.D. de 0,06" e I.D.....

Resultados

Após 48h de cultura sob fluxo de cisalhamento na BMFA, as células endoteliais cobriam a superfície dos canais vasculares na BMFA e se alinhavam na direção do fluxo (Figura 6). A microscopia confocal indicou que todas as superfícies dos canais vasculares estavam cobertas por células endoteliais, formando um lúmen 3D completo em bMFA¹⁸.

Usando este protocolo, um mapa de adesão de neutrófilos pode ser adquirido, mostrando que há uma.......

Discussão

O bMFA reproduz as condições de topografia e fluxo das redes microvasculares in vivo e pode ser usado para estudar a interação celular leucócito-endotelial e a função endotelial in vitro em condições fisiologicamente realistas. Na microvasculatura de camundongos ou humanos, a geometria das redes microvasculares são auto-similares e fractais, e o número reynolds << 1, indicando que a geometria vascular não afeta significativamente os padrões de fluxo. Portanto, o bFMA pode ser usado para est.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe	Fisher Scientific	14-823-30
Biomimetic microfluidic assay (bMFA)	SynVivo	SMN1-C001	Exclusive at SynVivo
Blunt needle	Jensen Global	JG24-0.5
Calcium Chloride	Fisher Scientific	C70-500
CFDA, SE	ThermoFisher	C1157
Dextran, 250,000, Powder	Spectrum Chemical Mfg. Corp	DE-130
Ficoll-Paque Premium	GE Health Care	17-5442-02	Leukocyte isolation media
fMLP	Sigma-Aldrich	F3506
Hepes	Fisher Scientific	AAJ1692630
Human fibronectin	Fisher Scientific	33-016-015	use vendor recommended ECM for different cell lines
Microvascular Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit	Lonza	cc-3202	Human lung microvascular endothelial cell culture medium (HLMVEC).
Human lung microvascular endothelial cells	Lonza	cc-2527	use vedor remommended trypsin-EDTA and TNS
Magnesium Chloride	Fisher Scientific	BP214-500
Nikon Eclipse Ti2	Nikon Instruments Inc.		Microscope
NIS-elements, 5.20.01	Nikon Instruments Inc.		Imaging software
PBS	Fisher Scientific	MT21040CV
PhD Ultra Syringe Pump	Harvard Apparatus	70-3007	Syringe Pump
Potassium Hydroxide	Fisher Scientific	02-003-763
Recombinant Human TNF-alpha	R&D Systems	210-TA
Slide clamp	SynVivo
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S640-500
Synvivo Pneumatic Primer	SynVivo
Trypsin-EDTA, Trypsin Neutralization Solution(TNS)	Lonza	cc-5034
Tygon tubing	Fisher Scientific	50-206-8921	Tubing