En robust arbejdsgang for behandling af kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) med cryoSPARC, RELION og Scipion

Nylige fremskridt inden for både instrumentering og billedbehandlingssoftware har gjort enkeltpartikel kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) til den foretrukne metode for strukturbiologer til at bestemme højopløsningsstrukturer af en lang række makromolekyler. Flere softwarepakker er tilgængelige for nye og ekspertbrugere til billedbehandling og strukturberegning, som strømliner den samme grundlæggende arbejdsgang: film erhvervet af mikroskopdetektorerne gennemgår korrektion for stråleinduceret bevægelse og kontrastoverførselsfunktion (CTF) estimering. Dernæst vælges og ekstraheres partikelbilleder fra gennemsnitlige filmrammer til iterativ 2D- og 3D-klassificering efterfulgt af 3D-rekonstruktion, forfining og validering. Fordi forskellige softwarepakker anvender forskellige algoritmer og kræver forskellige niveauer af ekspertise for at fungere, varierer de 3D-kort, de genererer, ofte i kvalitet og opløsning. Således overfører brugerne regelmæssigt data mellem en række programmer for optimale resultater. Dette papir giver brugerne en vejledning til at navigere i en arbejdsgang på tværs af de populære softwarepakker: cryoSPARC v3, RELION-3 og Scipion 3 for at opnå en næsten atomisk opløsningsstruktur af den adeno-associerede virus (AAV). Vi beskriver først en billedbehandlingspipeline med cryoSPARC v3, da dens effektive algoritmer og brugervenlige GUI giver brugerne mulighed for hurtigt at nå frem til et 3D-kort. I det næste trin bruger vi PyEM og interne scripts til at konvertere og overføre partikelkoordinater fra 3D-rekonstruktion af bedste kvalitet opnået i cryoSPARC v3 til RELION-3 og Scipion 3 og genberegne 3D-kort. Endelig skitserer vi trin til yderligere forfining og validering af de resulterende strukturer ved at integrere algoritmer fra RELION-3 og Scipion 3. I denne artikel beskriver vi, hvordan man effektivt udnytter tre behandlingsplatforme til at skabe en enkelt og robust arbejdsgang, der gælder for en række datasæt til bestemmelse af struktur i høj opløsning.