Een robuuste cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) verwerkingsworkflow met één deeltje met cryoSPARC, RELION en Scipion

Recente ontwikkelingen in zowel instrumentatie- als beeldverwerkingssoftware hebben cryo-elektronenmicroscopie met één deeltje (cryo-EM) tot de voorkeursmethode gemaakt voor structuurbiologen om structuren met hoge resolutie van een breed scala aan macromoleculen te bepalen. Meerdere softwaresuites zijn beschikbaar voor nieuwe en deskundige gebruikers voor beeldverwerking en structuurberekening, die dezelfde basisworkflow stroomlijnen: films die door de microscoopdetectoren zijn verkregen, ondergaan correctie voor beam-induced motion and contrast transfer function (CTF) schatting. Vervolgens worden deeltjesafbeeldingen geselecteerd en geëxtraheerd uit gemiddelde filmframes voor iteratieve 2D- en 3D-classificatie, gevolgd door 3D-reconstructie, verfijning en validatie. Omdat verschillende softwarepakketten verschillende algoritmen gebruiken en verschillende niveaus van expertise vereisen om te werken, verschillen de 3D-kaarten die ze genereren vaak in kwaliteit en resolutie. Gebruikers dragen dus regelmatig gegevens over tussen verschillende programma's voor optimale resultaten. Dit artikel biedt een handleiding voor gebruikers om door een workflow te navigeren in de populaire softwarepakketten: cryoSPARC v3, RELION-3 en Scipion 3 om een bijna atomaire resolutiestructuur van het adeno-geassocieerde virus (AAV) te verkrijgen. We beschrijven eerst een beeldverwerkingspijplijn met cryoSPARC v3, omdat de efficiënte algoritmen en gebruiksvriendelijke GUI gebruikers in staat stellen om snel tot een 3D-kaart te komen. In de volgende stap gebruiken we PyEM en interne scripts om deeltjescoördinaten van de beste kwaliteit 3D-reconstructie verkregen in cryoSPARC v3 naar RELION-3 en Scipion 3 te converteren en over te dragen en 3D-kaarten opnieuw te berekenen. Ten slotte schetsen we stappen voor verdere verfijning en validatie van de resulterende structuren door algoritmen van RELION-3 en Scipion 3 te integreren. In dit artikel beschrijven we hoe u drie verwerkingsplatforms effectief kunt gebruiken om een enkele en robuuste workflow te creëren die van toepassing is op een verscheidenheid aan datasets voor het bepalen van de structuur met hoge resolutie.