Ein robuster Einzelteilchen-Kryo-Elektronenmikroskopie-Verarbeitungs-Workflow (Kryo-EM) mit cryoSPARC, RELION und Scipion

Jüngste Fortschritte sowohl in der Instrumentierung als auch in der Bildverarbeitungssoftware haben die Einzelteilchen-Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) zur bevorzugten Methode für Strukturbiologen gemacht, um hochauflösende Strukturen einer Vielzahl von Makromolekülen zu bestimmen. Für die Bildverarbeitung und Strukturberechnung stehen neue und erfahrene Benutzer mehrere Software-Suiten zur Verfügung, die den gleichen grundlegenden Workflow rationalisieren: Filme, die von den Mikroskopdetektoren aufgenommen wurden, werden für die Schätzung der strahleninduzierten Bewegung und der Kontrastübertragungsfunktion (CTF) korrigiert. Als nächstes werden Partikelbilder ausgewählt und aus gemittelten Filmbildern für die iterative 2D- und 3D-Klassifizierung extrahiert, gefolgt von 3D-Rekonstruktion, Verfeinerung und Validierung. Da verschiedene Softwarepakete unterschiedliche Algorithmen verwenden und unterschiedliche Fachkenntnisse erfordern, unterscheiden sich die von ihnen generierten 3D-Karten häufig in Qualität und Auflösung. So übertragen Benutzer regelmäßig Daten zwischen einer Vielzahl von Programmen für optimale Ergebnisse. Dieses Dokument bietet eine Anleitung für Benutzer zum Navigieren in einem Workflow durch die gängigen Softwarepakete: cryoSPARC v3, RELION-3 und Scipion 3, um eine nahezu atomare Auflösungsstruktur des Adeno-assoziierten Virus (AAV) zu erhalten. Wir haben zunächst eine Bildverarbeitungspipeline mit cryoSPARC v3 detailliert beschrieben, da die effizienten Algorithmen und die benutzerfreundliche GUI es den Benutzern ermöglichen, schnell zu einer 3D-Karte zu gelangen. Im nächsten Schritt verwenden wir PyEM und interne Skripte, um Partikelkoordinaten von der besten 3D-Rekonstruktion in cryoSPARC v3 zu RELION-3 und Scipion 3 zu konvertieren und zu übertragen und 3D-Karten neu zu berechnen. Schließlich skizzieren wir Schritte zur weiteren Verfeinerung und Validierung der resultierenden Strukturen durch die Integration von Algorithmen aus RELION-3 und Scipion 3. In diesem Artikel beschreiben wir, wie Sie drei Verarbeitungsplattformen effektiv nutzen können, um einen einzigen und robusten Workflow zu erstellen, der auf eine Vielzahl von Datensätzen für die hochauflösende Strukturbestimmung anwendbar ist.